论文总字数：23635字

摘 要

丁二酸是一种四碳二羧酸，作为前体用于合成药品及生物可降解性聚合物中。为了提高丁二酸的产量，我们可以改变发酵策略，或者通过基因工程技术构建高转化效率，高产量丁二酸的优良菌株，从而提高丁二酸产量。

谷氨酸棒杆菌生产丁二酸过程中一个关键因素是充足的NADH供应。辅酶因子的浓度和辅酶因子活性形式的比例可能在改善丁二酸转化率方面发挥重要作用。来自大肠杆菌中的转氢酶基因（pntAB）可以直接催化可逆氢化物转移和调整NADP（H）和NAD（H）之间的动态平衡。因此，我们通过以大肠杆菌基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增出pntAB基因，并克隆到表达载体pXMJ19，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，通过筛选验证获得表达质粒pXMJ19-pntAB。将质粒pXMJ19-pntAB电转化入谷氨酸棒杆菌感受态细胞中。经过筛选，获得重组菌株Corynebacterium glutamicum NC-3-pntAB。通过测定对照菌株与重组菌株胞内辅酶浓度及比例的变化，分析转氢酶基因对谷氨酸棒杆菌生产丁二酸的影响。

关键词: 谷氨酸棒杆菌 PntAB 丁二酸产量 NADH供应

Abstract

Succinic Acid is a four carbon dicarboxylic acids , as precursors for the synthesis of drugs and biodegradable polymers. In order to improve the yield of succinic acid, we can change the fermentation strategy, or build a high conversion efficiency by genetic engineering techniques, excellent high-yield strains of succinic acid, to increase the yield of succinic acid .

The key factors in process of Corynebacterium glutamic acid product succinic acid is NADH adequate supply. The concentration of the active form of the enzyme cofactors and cofactor ratio may play an important role in improving the acid conversion rate. From E. coli transhydrogenase gene (pntAB) can catalyze the reversible hydride transfer and adjust the dynamic balance of NADP (H) and NAD (H). Therefore, we use E. coli genomic DNA as a template, PCR amplified pntAB gene, and cloned into the expression vector PXMJ19, transformed into E. coli JM109 competent cells, screening verification by obtaining expression plasmid pXMJ19-pntAB. The plasmid pXMJ19-pntAB glutamicum was transformed into competent cells. Get the recombinant strain Corynebacterium glutamicum NC-3-pntAB after screening. By measuring strain and recombinant strain control within the cell concentration and changes in the proportion of coenzyme ,analyze the impact of transhydrogenase gene in Corynebact glutamic acid product succinic acid.

Key words Corynebacterium glutamicum • PntAB • The yield of Succinic acid • NADH supply

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 丁二酸的生产研究概况 1

1.1.1丁二酸的理化性质 1

1.1.2 丁二酸的工业应用 1

1.1.3丁二酸的市场现状和前景 2

1.2 丁二酸的制备方法概述 2

1.2.1化学合成法 2

1.2.2生物转化法合成丁二酸 3

1.2.3发酵生产丁二酸 4

1.3 丁二酸的基因工程研究 5

1.3.1丁二酸合成途径的强化 5

1.3.2 NADH的应用及辅酶策略的研究 6

1.4 本实验研究的意义和主要内容 8

1.4.1 本实验研究的意义 8

1.4.2 本实验研究的主要内容 8

第二章 材料与方法 9

2.1实验材料 9

2.1.1 细菌菌株，质粒和DNA操作 9

2.1.2实验试剂 10

2.1.3 实验仪器 11

2.2实验方法 12

2.2.1实验所用的培养基及培养条件 12

2.2.2感受态细胞制备及转化条件 13

2.2.3 重组菌株C. glutamicum NC-3-pntAB的构建及验证 14

2.2.4 转氢酶酶活的测定 15

2.2.5 重组菌与原始菌体内NAD 、NADH、NADP 、NADPH浓度的测定 15

2.2.5 分析方法 16

第三章 结果与讨论 17

3.1 重组菌株C. glutamicum NC-3-pntAB的构建及验证 17

3.1.1 重组质粒pXMJ19-pntAB的构建及验证 17

3.1.2 重组菌株C. glutamicum NC-3-pntAB的构建及鉴定 17

3.2 pntAB表达对重组菌株转氢酶活性的影响 17

3. 3 转氢酶基因的表达对菌株细胞内NADH和NADPH的影响 18

第四章 结论与展望 21

4.1结论 21

4.2展望 21

参考文献 22

致谢 24

第一章 文献综述

1.1 丁二酸的生产研究概况

1.1.1丁二酸的理化性质

丁二酸，分子式为C4H6O4，,中文名称：琥珀酸，乙二甲酸，亚甲基二羧酸，英文名称：Succinic acid，丁二酸是三羧酸循环（TCL循环）中的四碳二羧酸中间产物，同时也是某些氨基酸的降解产物。分子量是118.09，纯净的丁二酸呈无色至白色单斜晶体，无臭，低毒，有特殊酸味，可燃。丁二酸具有两种晶型，熔点和沸点分别为185℃和235℃，相对密度为1.572(25/4℃)，折射率为1.452(20℃)。1g丁二酸溶于13mL的冷水，1mL的沸水，18.5mL的乙醇，6.3mL的甲醇，36mL的甘油和11mL的乙醚中^[1-2]，几乎不溶于苯，二硫化碳，四氯化碳和石油醚中。丁二酸是一种二元羧酸，因此具有二元酸大多数的典型反应，其分子内的亚甲基官能团很活泼，能够发生如氧化、还原、脱水、酯化、磺化、卤化、醚化等反应^[3-4]。

图1-1 丁二酸的构型

请支付后下载全文，论文总字数：23635字