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摘 要

漆酶是一种含铜多酚氧化酶，因为其稳定性好并且具有广泛的底物特异性，漆酶在废水处理，转换芳香族化合物，生物漂白和构建生物传感器等其它方面具有重要的意义。作为新型功能材料的磁性纳米粒子在固定化酶领域具有广阔的前景，其能实现酶的重复使用，使得过程连续化，并能实现底物与酶之间的有效分离。于是本文采用纯化分离的漆酶，使用目前较为常用的磁性纳米粒子进行了一系列固定化的相关探究，从而可以确定使用漆酶磁性纳米粒子固定化的在不同的戊二醛浓度梯度，固定化时间，pH，温度，漆酶浓度下的最佳条件，并对其具体固定化条件进行了相关探讨。

关键词：漆酶 磁性纳米粒子 固定化

Magnetic nanoparticles immobilized laccase

ABSTRACT

Laccase is a polyphenol oxidase containing copper, because it has a broad substrate specificity and good stability of laccase in wastewater treatment, biological bleaching, aromatic compound, biological sensors building has important application value. Magnetic nanoparticles is a kind of has a broad application prospect of new functional materials, applied to the study of immobilized enzyme which can realize continuous enzyme repeated use, process, and can achieve effective separation of enzyme and substrate. So this article use of magnetic nanoparticles for separation and purification of the immobilized laccase), to determine the magnetic nanoparticles immobilized laccase in glutaraldehyde concentration gradient, fixed time, pH, temperature, carrier load under optimum conditions, the immobilized under different conditions and the results are discussed in this paper.

Key words：laccase，magnetic nanoparticle ，immobilized

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述及本研究的目的和意义 1

1.1磁性纳米粒子概况 1

1.1.1磁性纳米粒子结构修饰 1

1.1.2 磁性纳米粒子固定化 3

1.1.3 磁性高分子微球 3

1.2 漆酶的概述 4

1.2.1 漆酶的发现 4

1.2.2 漆酶的催化特征 4

1.2.3 漆酶的应用 5

1.4 本课题研究思路和意义 7

第二章 材料与方法 7

2.1 材料 7

2.2 仪器 8

2.3 实验方法 8

2.3.1实验原理 8

2.3.2.Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备 9

2.3.3.Fe₃O₄纳米颗粒表面修饰 9

2.3.4.漆酶的固定化 10

2.3.5.漆酶固定化条件的优化 10

2.4 蛋白浓度的测定 11

2.5 漆酶酶活的测定 11

2.6 载体蛋白负载率的测定 12

2.7 固定化酶活回收率的测定 12

第三章 结果与讨论 12

3.1 戊二醛用量对固定化酶的影响 12

3.2 固定时间对固定化酶的影响 13

3.3 pH对固定化酶的影响 13

3.4 温度对固定化酶的影响 14

3.5 载体负载量对固定化酶的影响 15

第四章 结果与展望 15

4.1小结 15

4.2展望 16

参考文献 17

致谢 20

第一章 文献综述及本研究的目的和意义

1.1磁性纳米粒子概况

磁磁性纳米粒子由于其拥有较大的表面积，故可以在反应体系中均匀地分散，由于其表面更改性质也比较容易，适用于各种不同的活性基团，在整个反应中，其固定化酶体系中的传质阻力几乎为零，并且可以很容易地从外部磁场中分离回收再利用，使得使用该酶的成本花费很低。因为有着独特的磁性特性，磁性纳米粒子在生物医学范畴内具有极为广阔的发展远景，近些年以来获得了很高的关注率。磁性纳米粒子有着其独特的磁性特征，然而其生物相容性也相当不错。它的粒子比表面积较大，是因为其粒径小的缘故。在磁场的作用下可达到快速分离和回收等多种性能，目前，它被广泛应用于生物技术的各种领域，如固定化酶^[1]，药物靶向和药物递送^[2,3]，磁流体^[4]，造影剂^[5]，免疫分析^[6]，细胞分离^[7]，生物传感器^[8]，蛋白质纯化和核酸的分离^[9]以及癌症诊断^[10]。

1.1.1磁性纳米粒子结构修饰

磁性Fe₃O₄纳米粒子由于其独特的磁性特性在最近几年展现出了良好的应用前景，生物医药范畴的学者们对其产生了很大的兴趣。然而，在外部磁场中，磁性纳米粒子会获得偶极矩，偶极矩-偶极矩之间的相互作用引起磁性纳米颗粒形成一个链状的交联结构，导致磁性纳米粒子之间形成凝聚；除此之外，裸Fe₃O₄磁性纳米粒子的化学性质相当活泼，在空气当中非常容易被氧化而导致结构变化，导致它的磁性特性和磁性的分散性逐渐地丧失。磁性纳米粒子可以引入各种官能团以满足特定需求。

（1）有机小分子

根据需要，选择一种合适的偶联剂，然后用Fe₃O₄磁性纳米粒子处理其表面，并且可以引进某些官能团，以便后期的应用。还原-共沉淀法是比较常用的一种方法。谭家驹等^[11]磁性Fe₃O₄纳米粒子使用了这个方法部分制备了磁性纳米粒子。随后的表面修饰，采用了硅烷偶联氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷（AEAPS）进行实验。实验结果得到的纳米粒子表面氨基密度为0.5 umol/g、平均的粒径大小在20 nm左右。随后的固定化实验是将制备的磁性纳米粒子和组氨酸一起固定化而成的实验，最后用于偶联肝癌单抗。

（2）有机高分子

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