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摘 要

木聚糖酶一种能够对β-1，4-木糖苷键进行水解的酶。它是半纤维素酶类中具有代表性的组分，主要存在于微生物、植物和低等动物中，在食品、词料、制药、造纸、能源以及环境保护等多方面都有着重要的应用价值。本研究对来自Planomicrobium glaciei CHR43的木聚糖酶基因进行了表达，并对基因表达产物进行酶学性质分析。

含组氨酸标记的重组木聚糖酶Xyna在大肠杆菌中表达并纯化。Xyna的最适反应pH和温度分别为7.0和70℃。与其他嗜热及嗜温的的木聚糖酶相比，Xyna在高温条件下具有更高的活性，在50-80℃范围内仍有gt;60%的最高酶活，并且在90℃时仍有50%左右的酶活。Xyna还具有广泛的pH适应性(在pH 5.0-12.0的范围内酶活仍高于40%)和耐碱性(在4℃， pH 5.0-12.0条件下实验12h酶活仍有高于50%)，且有很高的耐热性(在50-90℃下实验1小时后酶活高于40%)。

本研究首次报道了Planomicrobium glaciei CHR43的耐热耐碱性木聚糖酶，通过对该菌来源的木聚糖酶的表达与酶学性质研究，证明该酶良好的酶学特性在造纸制浆工业中具有极大的应用潜力。

关键词：木聚糖酶 克隆 诱导表达 酶活测定

Expression and enzymatic properties of XnyA of Xylanases

ABSTRACT

β-Xylanases is glycosyl hydrolase which catalyzes random hydrolysis of β-l,4-xylosidic linkages.It is crucial hemicellulases and produced mainly by microorganisms,plants and lower animals. β-Xylanases has been widely used in many industry processes,such as pulp and paper,foodstuff,animal feed,pharmacy,energy and environmental protection.In this panper,a xylanase gene,designated Xyna,was expressed in E.coli and the gene expression product was characterized. A recombinant His-tagged xylanase,Xyna was expressed in E.coli BL21 and purified. The optimum pH is 7.0 while the optimum temperature is 70 ℃. Compared with thermophilic and mesophilic counterparts,Xyna was more active at high temperatures,retaining gt;60% of its maximum activity at 50-80℃ and about 50% activity stay at 90℃. It had broad pH adaptability (gt;40% activity at pH 5.0-12.0) and alkali-tolerance (gt;50% activity after incubation at pH 5.0-12.0 for 12 h at 4℃),and was highly thermostable (gt;40% activity after incubation at 50-90 ℃ for 1 h).It is the first alkali-tolerant thermostable xylanase reported from Planomicrobium glaciei CHR43.These favorable properyies make Xyna a good candidate for the application in pulp and paper industries.

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Keywords: xylanase;activity determination;inducible expression

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 2

1.1前言 2

1.2木聚糖 2

1.3木聚糖酶 3

1.3.1木聚糖酶的分类 4

1.3.2木聚糖酶的结构 4

1.3.3木聚糖酶的催化机制 4

1.4木聚糖酶的应用现状 6

1.4.1造纸工业 6

1.4.2动物饲料工业 7

1.4.3酒精发酵工业 7

1.5本研究的目的与意义 7

第二章 材料和方法 9

2.1材料 9

2.1.1菌株 9

2.1.2试剂 9

2.1.3培养基 9

2.1.4溶液 9

2.1.5仪器与设备 10

2.2实验方法 11

2.2.1目的质粒的提取 11

2.2.2目的质粒的酶切鉴定 11

2.2.3大肠杆菌感受态的转化 11

2.2.4重组子的筛选 12

2.2.5 XynA基因在大肠杆菌中的诱导表达 12

2.2.6木聚糖酶活力测定方法 12

2.2.7木聚糖标准曲线的绘制 12

2.2.8蛋白浓度的测定方法 12

2.2.9蛋白标准曲线的绘制 12

2.3酶学性质的测定 13

2.3.1酶的最适温度及对温度稳定性 13

2.3.2最适pH与pH稳定性 13

2.3.3 EDTA及金属离子对酶活性的影响 13

第三章 结果与讨论 15

3.1 目的质粒的提取及酶切鉴定 15

3.2 木聚糖酶的纯化 15

3.3木聚糖标准曲线 16

3.4产物蛋白含量的评价 16

3.5温度对酶活的影响 17

3.6 PH对酶活的影响 18

3.7 EDTA及金属离子对酶活的影响 19

第四章 结论与展望 21

4.1结论 21

4.2研究展望 21

参考文献 22

致 谢 26

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