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摘 要

谷氨酰胺转氨酶又称蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转移酶（EC 2.3.2.13,TGase transglutaminase），他是一种能够催化转移酰基的酶，遍及哺乳动物、植物、微生物机体。由于他能够直接改变蛋白质本身及其附着的细胞、组织等的功能，近年来已被国内外科学家进行深入的研究，在食品生产、化妆品、纺织行业有着广阔的应用前景。

本实验以重组大肠杆菌E.coli（DE3）作为出发菌株，以提高谷氨酰胺转氨酶的活性与蛋白表达量为研究目标，对已构建好的表达TG酶的工程菌的发酵条件进行研究，探索出其产物生产的最适条件。通过改变摇瓶发酵条件（装液量、温度、接种量），分析这些条件对菌株的酶活及其生物量的影响，得出最佳发酵条件：250ml的摇瓶装液25ml、发酵温度37℃、接种量6%；通过改变IPTG的浓度和诱导时长，运用SDS-PAGE电泳分析这些条件对目的蛋白表达量的影响，得出结论：0.08mmol/L浓度的IPTG和4小时的诱导时间是最佳的诱导条件。运用这些最佳发酵条件进行摇瓶发酵，最终酶活力达到8.15U/ml，蛋白表达量达到31.2%。

关键字：谷氨酰胺转氨酶 重组大肠杆菌 培养条件的优化

Study and optimization of fermentation condition of recombinant Escherichia coli producing glutamine aminotransferase with shake flask culture

Abstract

Transglutaminase which is also known as protein- glutamate-γ-glutamyltransferase（EC2.3.2.13,TGase）,it is a kind of enzyme that is able to catalyze and transfer acyl, it is widely distributed in various mammal animals, plants and microorganisms. TGase has been studied thoroughly by national and international scientists recent years, because it can change the function of protein itself and attached cells and tissues, so this kind of enzymes have broad application prospects in the fields of food production, cosmetic industry and textile industry.

Recombinant escherichia coli(DE3) was used as the producing strain in this experiment, the main aim was to improve enzyme activity and protein expression. We conducted a study on fermentation conditions of built-up expressing transglutaminase’s engineering bacteria and optimized the appropriate manufacturing condition of product. We analyzed how these factors affected enzyme activity of strains and biomass concentration by altering shake flask fermentation condition (liquid volume, temperature and inoculum size). In addition, we found out the best fermentation condition:25ml liquid volume in 250ml shake flask, fermentation temperature 37℃, 6% inoculum size. We also analyzed how these factors influenced the expression of target protein through altering revulsant concentration and induction time and applying SDS-PAGE electrophoresis. We could draw a conclusion that revulsant concentration 0.08mmol/L and induction time 4 hour are the better induction condition. On the basis of the appropriate condition, enzyme activity reached to 8.15U/ml and expression of protein reached to 31.2% in the end.

Key Words: Transglutaminase; recombinant escherichia coli; optimization of fermentation condition

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1谷氨酰胺转氨酶的简介 1

1.2谷氨酰胺转氨酶的来源 1

1.2.1微生物来源的谷氨酰胺转氨酶 1

1.2.2动物和植物来源的谷氨酰胺转氨酶 2

1.3 谷氨酰胺转氨酶的理化性质 3

1.3.1 微生物、动物、植物来源的TG酶理化性质的对比 3

1.4谷氨酰胺转氨酶的作用机制 4

1.5谷氨酰胺转氨酶的研究进展 5

1.6谷氨酰胺转胺酶的应用 5

1.6.1在纺织加工中的应用 5

1.6.2在皮革加工中的应用 6

1.6.3 在食品加工中的应用 6

1.6.4在其他产品上的应用 8

第二章 实验的材料与方法 10

2.1 实验材料 10

2.1.1 菌株 10

2.1.2 仪器 10

2.1.3 培养基 10

2.1.4 试剂（见表2-2） 11

2.2 培养方法 12

2.2.1 工程菌的筛选与保藏 12

2.2.2 种子的培养与发酵 12

2.3 测量方法 12

2.3.1生物量的测定 12

2.3.2 酶活的测定 12

2.3.3重组蛋白表达量的测定 13

第三章 实验结果与讨论 14

3.1 发酵条件的优化 14

3.1.1 不同装液量对菌体产酶的影响 14

3.1.2 不同温度对菌体产酶的影响 14

3.1.3 不同接种量对菌体产酶的影响 15

3.1.4 不同IPTG浓度对菌体产酶的影响 16

3.1.5 不同诱导时长对产酶的影响 17

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致谢 22

第一章 文献综述

1.1谷氨酰胺转氨酶的简介

谷氨酰胺转氨酶又称蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转移酶（EC 2.3.2.13,TGase transglutaminase）是一种能够在蛋白质间催化异构键形成并转移酰基的酶。在反应中，把肽链中的谷氨酰胺残基γ-酰胺基作为酰基供体，催化蛋白质分子内、分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接与蛋白质分子内谷氨酰胺酰基的水解^[1]，缩氨酸中的谷酰胺盐残基的γ-酰胺基与赖氨酸残基的ε-氨基发生转移反应，形成ε-(γ-谷胺酰)赖氨酸交联,从而改变各种蛋白质的结构和功能性质(乳化性、起泡性等物理性质)^[2]；另外， 谷氨酰胺转氨酶将催化脱氨反应如果没有游离氨基的话，这种情况下水会被当作为酰基受体，氨基从谷氨酰胺残基上被脱去并产生谷氨酸残基，从而改变蛋白质的黏性、热稳定性与溶解度^[3]。

综上所述，该酶能够直接改变蛋白质本身及其附着的细胞、组织等的功能，因此在食品加工、化妆品制造、纺织产业、制药等领域具有广阔的应用远景^[4]。

1.2谷氨酰胺转氨酶的来源

TGase 遍及不同的哺乳动物组织、无脊椎动物、体液及植物和微生物机体，他与许多生命征象有关，例如伤口愈合、表皮角质化或者红细胞膜的硬化^[5]。同时，TG酶也负责细胞生长分化增殖的管理，他的生理学性能已经被研究。从动物中得到的TG酶是钙离子依赖性酶，他大多数分布在器官、皮肤或血液中。到目前为止，已发现几内亚猪肝TG酶^[6]，人体表皮角化细胞TG酶^[7]和人体血液凝结因数ⅩⅢ。从轮枝链霉菌中可以获得不依赖钙的活性的TG酶。尽管动物和植物来源的TG酶在氨基酸组成中缺少同源性，但是他们所展现出的催化活性和生化性质与微生物来源的TG酶相似。

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