论文总字数：14694字

摘 要

本文对巴斯德毕赤酵母的概念，特性，研究状况，应用情况进行了说明，并介绍了巴斯德毕赤酵母在发酵工程以及制药中的原理及应用。本研究首先分析毕赤酵母的生长曲线，选择合适的接种种龄。同时设计相关正交实验，分别探究了发酵前期和诱导合成时期所适宜的温度和pH。使用尾气分析的方式间接探明了毕赤酵母在发酵中的临界溶氧值。最后总结优化目前的甲醇补料方式，结合实际生产情况，提出以根据在线溶氧即时反应情况，结合离线气象监测使用不同浓度的甲醇甘油混合溶液的分批补料策略以提高甲醇诱导的胰岛素前体蛋白的表达量。

关键词：巴斯德毕赤酵母 发酵工艺 甲醇

Study on the principle and fermentation process of methanol - induced protein in Pichia pastoris

Abstract

In this paper, the concept, characteristics, research status and application of Pichia pastoris yeast are described. And the principle and application of Pichia pastoris yeast in fermentation engineering and pharmaceutical industry were introduced. In this study, we first analyze the growth curve of Pichia pastoris, select the appropriate inoculum age. At the same time, orthogonal experiments were designed to explore the appropriate temperature and pH in the early stage of fermentation and the induction of synthesis. Analysis of exhaust gas indirectly proved the OUR. At last, the method of methanol feeding is summarized,we put forward the method of methanol feeding according to the DO% and Gas chromatograph

KEYWORDS：Pichia pastoris fermentation techniques Methanol

目 录

摘 要 I

Abstract II

目录 III

第一章 前言 1

1.1 巴斯德毕赤酵母的研究现状 1

1.2 本研究的目的和意义 1

第二章 文献综述 2

2.1 巴斯德毕赤酵母的概念 2

2.2 巴斯德毕赤酵母的表达系统 2

2.2.1巴斯德毕赤酵母表达系统特性 2

2.2.2巴斯德毕赤酵母表达系统表达外源蛋白 3

第三章 实验方法 5

3.1 实验材料 5

3.2 接种种龄的确定 5

3.3发酵温度的确定 6

3.4发酵溶氧的确定 6

3.5发酵pH的确定 7

3.6甲醇补料策略的确定 8

第四章 实验结果与分析 10

4.1发酵的基本参数 10

4.1.1生长曲线与接种种龄 10

4.1.2发酵温度 10

4.1.3发酵溶氧 10

4.1.4发酵pH 11

4.2甲醇补料发酵的结果 11

参考文献 20

致 谢 22

第一章 前言

1.1 巴斯德毕赤酵母的研究现状

自从研究人员1987年首次发现能够以单一的甲醇为碳源的巴斯德毕赤酵母，人们已经成功分离出了其相关代谢途径的酶的基因序列，构建了相关的重组载体，开发出了与之相适应的转基因技术，结合单细胞真核生物酿酒酵母等的发酵工艺，已经实现了外源重组蛋白质的高表达^[1]。

毕赤酵母的表达系统与原核生物的表达系统相比，可以分泌外源蛋白到胞外和具有蛋白翻译后增加修饰的能力，因此毕赤酵母的表达系统中可以成功表达许多在诸如IPTG诱导的大肠杆菌中难以表达或者产量较低的物质^{[1] [2]}。毕赤酵母具有生产成本较低，产物应用方面广，产能大等诸多优点，因此其在生物制药业中受到越来越多的重视^[3]。

曾经大肠杆菌是表达外源基因的模板生物之一，但是属于细菌的一种，是结构较为简单的原核生物，其本身有着不能表达复杂蛋白质或者表达蛋白质活性较低，同时分泌型蛋白表达的产量不理想^[2][3]。而巴斯德毕赤酵母广泛应用于各种规模的的蛋白质表达、制备以及结构分析等方面，已经有数以千计的外源蛋白在毕赤酵母系统中得到成功地表达^[3]。巴斯德毕赤酵母的在工业发酵的大规模应用上有着以下五个优点：

(1)能够在碳源只有甲醇的培养基上存活并且生长。由于巴斯德毕赤酵母体内含特殊的醇氧化酶, 能够在碳源或能源只有甲醇的培养体系中存活并且生长几乎不受抑制,甚至能够达到非常高的菌体数量。在这里。甲醇是醇氧化酶的诱导剂；而当以Glu作为碳源时，AOX1启动子几乎不表达，以甘露醇山梨醇等为底物时，醇氧化酶不会被抑制^[3][4]。

(2)表达高效。生长迅速,在一般培养基中依旧能到非常高的菌浓, 和独特AOX1基因强启动子, 是较为适宜的表达载体,外源蛋白的表达产量甚至可以达到蛋白总数四成^[5]。

(3)适用于表达分泌到不同场所的蛋白。

(4)基因遗传具有高稳定性。被插入的基因不是像大肠杆菌那样导入到会独立遗传的质粒当中,而是随载体同源重组整合到染色体上,随酵母的繁殖一起遗传,极大避免了外源基因的丢失现象^[6]。

(5)能够进行蛋白的糖基化修饰: N-、O-糖基化对于蛋白正确折叠、发挥相应的药物活性非常重要^[7][8]。毕赤酵母外源蛋白的糖基化程度较低。同时,毕赤酵母分泌的外源蛋白具有的抗原性远远低于其他酵母。这一点在一定程度上避免在药物使用中引起免疫反应^[9]。因此，分泌的蛋白更适合于药物治疗用途。

近些年，毕赤酵母被FDA认定GRAS微生物，在医药蛋白领域，已有胰岛素、疫苗、表皮生长因子等多种蛋白使用实现商品化制备，在工业酶制剂领域，也有许多酶制剂实现了工业化生产^[3]。

1.2 本研究的目的和意义

请支付后下载全文，论文总字数：14694字