论文总字数：15575字

摘 要

氢能作为接近零消耗能源，被认为是环保的洁净能源，正受到当今全球的广泛关注。最近，生物制氢研究大多采用厌氧发酵和生物制氢的方法。特别地，生物制氢技术有可能成为人类实现可持续发展的关键技术。产气肠杆菌作为产氢主要菌属之一，适应温度范围广，能够利用葡萄糖，半乳糖，果糖，甘露醇，蔗糖，麦芽糖，淀粉，纤维素等进行厌氧发酵制氢，主要产生乙醇，3-烃基丁醇和有机酸。

现已研究表明E. aerogenes 的产氢代谢途径为甲酸途径和“NADH途径”，其中E. aerogenes 的“NADH途径”为：胞外添加的NADH通过与 E. aerogenes 细胞接触被氧化为 NAD ，产生的电子传递到胞内质子从而生成氢气^[1]，因此提高还原力对E. aerogenes促进产氢有着重要意义。

NADH氧化途径是体内最主要的生物氧化途径。在此途径中，NAD 和 NADH陪同着质子和电子的产生互相交替转化。NAD 合成酶存在于大多数生物体中，是NAD 从头合成途径和再生途径共有的最后一步催化反应的关键酶，在 NAD 合成方面占着极其重要的位置。

本文研究了工程菌pET-22b-NADS和E. aerogenes 混合体系产氢的效果，并对混合培养体系进行了碳源、接种量、接种比例、温度等条件的优化。

关键字：产气肠杆菌 发酵产氢 NADH途径

Abstract

Hydrogen as a low carbon and zero carbon energy, is considered a green clean energy, is being widely concerned by the world today. In recent years, most of the biological hydrogen production research using anaerobic fermentation and biological hydrogen method.In particular, bio-hydrogen production technology may be the key to sustainable development of human technology. Enterobacter aerogenes as one of the main strains of hydrogen production, to adapt to a wide temperature range, can use glucose, galactose, fructose, mannitol, sucrose, maltose, starch, cellulose and other anaerobic fermentation hydrogen, mainly produce ethanol, 3-alkyl butanol and organic acids.

It has been shown that E. hydrogenogen's metabolic pathway of hydrogen production is the formic acid pathway and the "NADH pathway",Where E. aerogenes' "NADH pathway" is:The extracellular addition of NADH is oxidized to NAD by contact with E. aerogenes cells, and the resulting electrons are transferred to the intracellular protons to produce hydrogen, thus

increasing the reducing power is important for E. aerogenes to promote hydrogen production.

NADH oxidation pathway is the most important biological oxidation pathway in vivo. In this pathway, NAD and NADH are accompanied by the alternation of the generation of protons and electrons.NAD synthase is present in most organisms and is the key enzyme in the last step of the NAD de novo synthesis pathway and regeneration pathway, which plays an important role in NAD synthesis.

In this chapter, the effects of hydrogen production from the pET-22b-NADS and E. aerogenes mixtures were studied.And the carbonation, inoculation amount, inoculation ratio and temperature were optimized for the mixed culture system.

Key Words：NAD Synthetase；Gene Clone；Enzymatic Properties

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 前言 1

1.1 发酵产氢现状 1

1.2 产气肠杆菌简介 1

1.3 产气肠杆菌产氢性质和机理 2

1.4 “NADH途径”产氢简介 2

1.5 NAD合成酶的简介 3

1.6研究内容与展望 3

第二章 实验材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1序列与质粒 5

2.1.2 实验试剂 5

2.2实验仪器 6

2.3 实验内容 6

2.3.1 厌氧纯培养体系E. aerogenes的生长变化 6

2.3.2 工程菌与E. aerogenes混合体系联合产氢的研究 6

2.3.3 混合培养体系的条件优化 7

第三章 结果与讨论 8

3.1 E. aerogenes厌氧产氢随生长的变化 8

3.2 工程菌与E. aerogenes混合体系联合产氢的研究 8

3.3 混合培养体系的条件优化 9

3.3.1碳源对混合培养体系发酵产氢的影响 9

3.3.2接种比例对混合培养体系发酵产氢的影响 12

3.3.3接种量对混合培养体系发酵产氢的影响 13

3.3.4温度对混合培养体系发酵产氢的影响 15

3.3.5优化条件下混合培养体系发酵产氢的研究 16

参考文献 17

致谢 20

第一章 前言

近年来，煤、石油、天然气等非可再生能源储量日益减小，面临着枯竭的危险且其燃烧产生了大量的污染物质，包括 CO₂的排放引起的温室效应。^[1]氢是高效洁净的能源，它拥有高温、高能、热能集中等安全优势，被认为是一种纯净能源，受到各国各地越来越多的关注。

微生物是借助自身作用，在必定的环境前提下，利用新陈代谢产生氢气。特别地，生物制氢方法有希望成为人类实现可持续发展的关键技术。现已研究表明E. aerogenes 的产氢代谢途径为甲酸途径和“NADH途径”，其中E. aerogenes 的“NADH途径”为^[2]：胞外添加的NADH通过与 E. aerogenes 细胞接触被氧化为 NAD ，产生的电子传递到胞内质子从而生成氢气，因此提高还原力对E. aerogenes促进产氢有着重要意义。

1.1 发酵产氢现状

在发酵产氢的探索中，糖类是最普遍的基底，从工艺经济的角度来看，我们最好利用廉价的碳源。因此，研究人探索了一系列以工业，城市废弃物，废气生物量为底物进行厌氧发酵制氢的探索。目前，除了人造蔗糖类似的虚拟系统之外，现在拿来转变氢气的生物量包含了淀粉，都市固体有机丢弃物，糖蜜废水等^[3]。从基底成份来研究，产氢菌不仅能够利用普通六元糖，还能够利用木糖，几丁质等物质，这大范围的扩张了发酵生物制氢的基底利用范围^[4]。但是，利用非六元糖为基底制造氢的过程反应较慢，而且在将不同形式的物品转换为微生物能够使用的糖的预处理步骤中却面对着很多问题，比如路径繁杂，得到糖的效率较低。这些都有待于深入研究解决^[5]。

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