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摘 要

在手性生物催化加氢反应过程中，辅酶（NADH，NADPH）对氧化还原反应是必不可少的。反应中辅酶浓度大小是决定速率的重要原因。然而，辅酶价格十分昂贵，在反应体系中如果采取大量添加的措施是不现实的。所以，提高胞内辅酶浓度对于促进生物手性加氢反应系统的应用有很大意义。提高胞内NAD含量可以促进NADH的生成 ，因此，提高胞内NAD含量对于提高生物手性加氢反应速率是一种可行的实验方案。本课题中，对从嗜热链球菌中得到的NAD合成酶NadR，先把它构建到pET-28a表达载体中，然后转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）中，表达并鉴定其功能。然后在双酶偶联体系中加入NAD合成酶且不添加辅酶NAD的情况下，进行（S）-NBHP的不对称合成，并同双酶偶联反应过程进行比较。本文较为全面的的综述了NadR基因的表达、pET-28a-NadR目的基因的构建以及诱导表达。在Escherichia coli BL21(DE 3) 中表达，通过采用双酶偶联法测定其酶学活性为8U/mg蛋白。并在双酶偶联体系中加入NAD合成酶且不添加辅酶NAD的情况下，进行（S）-NBHP的不对称合成，产物产量与对照组基本一致。

关键词：手性 偶联 不对称合成 诱导表达

Effects of overexpression of NAD synthase on chiral hydrogenation of recombinant Escherichia coli

Abstract

In the course of chiral biocatalytic hydrogenation, coenzyme (NADH, NADPH) is essential for redox reactions. The concentration of coenzyme during the reaction is an important factor affecting the reaction rate. However, the coenzyme price is very expensive, in the reaction system if a large number of measures to add is unrealistic. Therefore, increasing the concentration of intracellular coenzyme for the promotion of biological chiral hydrogenation reaction system is of great significance. Increasing intracellular NAD content can promote the production of NADH. Therefore, increasing the intracellular NAD content is a feasible experimental scheme for improving the rate of biological chiral hydrogenation. In this study, Nad synthase NadR, which was obtained from Streptococcus thermophilus, was first constructed in pET-28a expression vector and transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) to express its function. Then, asymmetric synthesis of (S) -NBHP was carried out in the case of adding NAD synthase in the double enzyme coupling system without adding coenzyme NAD, and compared with the double enzyme coupling reaction process. This article summarizes the expression of NadR gene, the construction of pET-28a-NadR gene and the induction expression. Was expressed in Escherichia coli BL21 (DE 3) and its enzymatic activity was 8 U / mg protein by double enzyme coupling assay. (S) -NBHP was synthesized by adding NAD synthase in the double enzyme coupling system without adding coenzyme NAD. The yield of the product was basically the same as that of the control group.

Key Words: Chiral；Coupling；Asymmetric synthesis；Induced expression

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 手性、手性技术及手性生物催化 1

1.1.1手性 1

1.1.2手性药物 1

1.1.3手性生物催化 1

1.2辅酶 2

1.2.1定义 2

1.2.2分类 2

1.2.3辅酶I简介 2

1.2.4 辅酶I的合成 3

1.3本课题的立题背景、意义及研究内容 4

第二章 NAD合成酶的克隆表达及功能鉴定 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 常用仪器 5

2.1.2 实验试剂 6

2.1.3 工具酶及试剂盒 6

2.1.4 菌株与质粒 7

2.1.5 培养基及培养方法 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 目的基因NadR的扩增 8

2.2.2 质粒pET-28a的提取及酶切 9

2.2.3 重组质粒的构建 11

2.2.4 重组载体的转化及重组菌的鉴定 12

2.2.5 重组菌的诱导表达 13

2.2.6 目的蛋白NadR的酶活测定 13

2.3 结果与讨论 14

2.3.1 目的基因的PCR扩增 14

2.3.2 双酶切目的基因片段 15

2.3.3 重组载体的构建及重组菌鉴定 15

2.3.4 NadR的诱导表达及酶活测定 15

第三章 过表达NadR对大肠杆菌手性催化加氢系统的影响研究 18

3.1 前言 18

3.2 实验材料及仪器 18

3.3 实验方法 19

3.3.1 重组酶CprCR- GDH的制备 19

3.3.2 NAD合成酶在双酶偶联不对称合成（S）-NBHP中的作用 19

3.3.3 反应底物及产物的检测 20

3.4 结果与讨论 20

3.4.1 NAD合成酶在双酶偶联催化（S）-NBHP不对称合成中的作用 20

第四章 结论及展望 22

4.1 结论 22

4.2 展望 22

参考文献 23

致 谢 25

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