论文总字数：23085字

摘 要

随着经济和社会的发展迅猛，人们对生活水平的要求较高，尤其体现在日常饮食中对高嘌呤食品的无节制摄取，导致尿酸含量的积累，从而引发痛风等高尿酸疾病。尿酸的形成过程主要是通过各类嘌呤经过催化作用生成尿酸。本研究利用酶法解决尿酸问题，主要是通过黄嘌呤脱氢酶和尿酸氧化酶来降解次黄嘌呤和黄嘌呤的方式来降低尿酸含量。目前，降低嘌呤有很多种方式，其中，生物法要比化学合成法更加的简单便捷、安全高效，生物法中基因的重组构建产酶是最常见的方式。

本试验利用来源于枯草芽孢杆菌全基因组中的黄嘌呤脱氢酶和尿酸氧化酶基因，将两个基因分别构建在穿梭质粒pHT01，最终导入到宿主菌为Bacillus subtilis WB800N进行重组表达，确定两种重组菌为Bacillus subtilis A1-1、Bacillus subtilis B2-2。实验主要采用已构建的Bacillus subtilis A1-1对黄嘌呤脱氢酶进行催化作用生成尿酸，再利用Bacillus subtilis B2-2表达尿酸氧化酶来降解上一步催化反应中的产物——尿酸，生成对人体无害的尿囊素，从而达到降低嘌呤和尿酸量的效果。

关键词：尿酸氧化酶 黄嘌呤脱氢酶 枯草芽孢杆菌 嘌呤

Expression and Application of Uric Acid Oxidase and Xanthine Dehydrogenase in Bacillus subtilis

ABSTRACT

With the rapid economic and social development, people have higher requirements for living standards, especially in the daily diet of uncontrolled intake of high purine foods, resulting in the accumulation of uric acid content, causing gout and other high uric acid diseases. The formation of uric acid is mainly catalyzed by various purines to produce uric acid. This study used enzymatic methods to solve the problem of uric acid, mainly through xanthine dehydrogenase and uric acid oxidase to degrade hypoxanthine and xanthine to reduce uric acid content.At present, there are many ways to reduce purines. Among them, biological methods are simpler, more convenient, safer, and more efficient than chemical synthesis methods. Gene recombination in biological methods is the most common way to produce enzymes.

In this study, xanthine dehydrogenase and urate oxidase genes from the whole genome of Bacillus subtilis were used to construct two genes in the shuttle plasmid pHT01, and finally introduced into the host strain Bacillus subtilis WB800N for recombinant expression. The recombinant strains were Bacillus subtilis A1-1 and Bacillus subtilis B2-2. Bacillus subtilis A1-1 was used to catalyze the synthesis of xanthine dehydrogenase to produce uric acid, and Bacillus subtilis B2-2 was used to express urate oxidase to degrade the product in the previous step reaction—uric acid, and produce it to the human body. Harmless allantoin, so as to reduce the effect of purine and uric acid.

Keywords：Uric acid oxidese; xanthine dehydrogenase; Bacillus natto; purine

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 嘌呤的研究进展 1

1.3 尿酸氧化酶的研究进展 2

1.4 黄嘌呤脱氢酶的研究进展 3

1.5 枯草芽孢杆菌的研究进展 3

1.6 研究前景及展望 4

1.7 研究内容 4

第二章 实验材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 菌株和质粒 6

2.1.2 主要实验试剂 6

2.1.3 主要实验仪器 7

2.1.4 分子相关试剂 8

2.1.5 培养基和培养方法 8

2.2 菌种的构建 9

2.2.1 目的基因的提取 9

2.2.2 连接基因和质粒 10

2.2.4 枯草芽孢杆菌电转化 11

2.2.5 重组菌株的构建 12

2.2.6 蛋白凝胶电泳 12

2.2.7 重组蛋白诱导表达及粗酶液制备 13

2.3 降解嘌呤酶酶活性测定 13

2.3.1 黄嘌呤脱氢酶活性的测定 13

2.3.2 尿酸氧化酶活性的测定 14

第三章 实验结果与讨论 15

3.1 质粒的重组 15

3.2 双酶切验证 15

3.3 重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳 16

3.4 重组菌株的筛选及酶活测定 18

3.5 重组尿酸氧化酶和黄嘌呤脱氢酶的酶学性质 19

3.6 结果与讨论 21

第四章 结论与展望 22

参考文献 23

致 谢 28

第一章 文献综述

1.1 前言

随着经济和社会的发展迅猛，人们对生活水平的要求越来越高，同时消费水平不断提高，在日常饮食中对高嘌呤、高蛋白食物超标摄入，导致嘌呤代谢紊乱，尿酸积累，形成痛风。人体的尿酸来自于食物分解或者体内合成，尿酸增加和肾脏排泄减少会引起血清尿酸水平的升高^[1]。一旦尿酸在血液中浓度超出7mg/dl，就会导致体液pH下降。尿酸以Na 的形式沉积在关节、肾脏等部位中，形成痛风，严重者的肾功能会有一定程度的损害^[2]。

在嘌呤代谢的过程中，次黄嘌呤、黄嘌呤经过黄嘌呤脱氢酶或者氧化酶作用生成尿酸，一旦尿酸在血液中浓度超出7mg/dl，就会导致体液pH下降，使人体细胞不能发挥正常功能，引发痛风等疾病^[3]。目前放眼全世界，患有高尿酸血症人越来越多，这已经对人们的健康造成了极大的威胁。因此，解决嘌呤类的问题刻不容缓。降低嘌呤有很多种方式，其中，生物法要比化学合成法更加简单便捷、安全高效，生物法中最常见的方式是基因的重组构建产酶。

1.2 嘌呤的研究进展

嘌呤（Purine）在核酸的组成中占有很大的比例，在人体内的主要存在形式是嘌呤核苷酸。嘌呤作为参与体内新陈代谢过程的非常重要的物质，在提供能量、对于代谢的调节及作为辅酶的重要组成部分等方面发挥着非常重要的作用^[4]。在人体内嘌呤物质主要存在四种分别为：腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤和黄嘌呤。

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