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摘 要

近年来，由于煤、石油等有机高分子化合物的不完全燃烧所产生的多环芳烃越来越多，因此人们迫切得到一种有效的方法来去除环境中的多环芳烃污染物。具有两个苯环的萘因为它的毒性十分强并且作用时间很持久，对人类的各种系统都能产生影响，例如呼吸系统，生殖系统，免疫系统等而被纳入有机污染物中的黑名单。它对环境造成的破坏早已成为我们日常关注的热点，消除环境中的多环芳烃萘不仅是科研人员奋斗的核心目标，也是国内外研究的热点。而利用微生物降解萘的操作简单方便、成本较低、不会造成二次污染,这使它成为降解多环芳烃萘的主要方法。本实验基于南京某石化污水处理厂的污泥，利用萘选择培养基来筛选、分离出一株以萘为唯一碳源的菌株L5，并通过革兰氏染色以及16SrDNA基因测序并在数据库中对比出与其同源性最高的已知菌株，发现其属于戈登氏菌属。通过改变接种量、初始pH、温度来进行实验，最终确定其最佳接种量为2%。在初始pH为7.2，30°C的培养温度时菌株L5生命力最活跃。因此在此最佳条件下探究了它的降解性能。

关键词 萘降解菌 16SrDNA基因测序 分离鉴定 降解特

ABSTRACT

In recent years, polycyclic aromatic hydrocarbons have been produced due to incomplete combustion of organic polymer compounds such as coal and petroleum. It is very toxic and lasts for a long time. Its environmental damage has long been a hot topic of our daily attention, so people are eager to get an effective way to remove polycyclic aromatic hydrocarbon pollutants in the environment. Eliminating polycyclic aromatic hydrocarbons in the environment is also the core goal of researchers, and it is also a hotspot of research at home and abroad. Microbial degradation is the main cause of removing polycyclic aromatic hydrocarbons due to its advantages of simple operation, low processing cost and no secondary pollution. means. Based on the sludge from a petrochemical wastewater treatment plant in Nanjing, this experiment screened a strain L5 with naphthalene as the sole carbon source through naphthalene selection medium, and compared it with Gras stain and 16SrDNA gene sequencing. Known strains with the highest origin, thereby determining their classification and measuring their growth curves. A simple analysis of the degradation characteristics by changing the inoculum size and pH value finally determined that the optimum pH was 7.2 and the inoculum size was 2%.

KEYWORDS Naphthalene degrading bacteria，clementines，16SrDNA gene sequencing， Gram stain separation，Degradation characteristics

目 录

摘 要 2

ABSTRACT 3

第一章 绪论 6

1.1 前言 6

1.2 国内外研究现状 6

1.2.1 国外研究进展 7

1.2.2 国内研究进展 7

第二章 实验材料与方法 8

2.1 材料与试剂 8

2.1.3 培养基 8

2.2 仪器与设备 9

2.3 方法 9

2.3.1 菌株的筛选与纯化 9

2.3.1.1 初筛 10

2.3.1.2 复筛及纯化 10

2.3.3 菌株常规生长曲线的测定 10

2.3.4 生长特性分析（接种量、pH、温度、萘浓度） 10

2.3.4.1 接种量的影响 10

2.3.4.2 pH值的影响 11

2.3.4.3 温度的影响 11

2.3.4.4 菌株在以萘为唯一碳源的M9培养基中的最适培养浓度测定 11

2.3.5 萘浓度的测定以及萘标准曲线的绘制 12

2.3.5.1 萘浓度的测定 12

2.3.5.2 萘标准曲线绘制 13

2.3.6 菌株的鉴定 13

2.3.6.1 形态特征观察 13

2.3.6.2 革兰氏染色步骤 13

2.3.6.2 菌株的16SrDNA基因测序与鉴定 14

2.3.7 菌株萘降解特性（接种量、温度、pH） 14

第三章 结果与讨论 15

3.1 萘降解菌株的筛选及鉴定 15

3.1.1 菌株的形态学特征 15

3.1.2 16SrDNA序列测定结果及分析 15

3.2 菌株常规的生长曲线 16

3.3 不同条件对菌株生长的影响 17

3.3.1 接种量的影响 17

3.3.2 pH值的影响 18

3.3.3 温度的影响 18

3.3.4 菌株在以萘为唯一碳源的M9培养基中的最适培养浓度测定 19

3.4 萘降解性能的测定（温度、接种量、pH） 20

第四章结论与展望 22

4.1结论 22

4.2展望 22

参考文献 23

致 谢 25

第一章 绪论

1.1 前言

在日益进步的科学技术水平下，传统的燃料消耗速度已经跟不上时代发展的脚步。其中燃料不完全燃烧排放的多环芳烃对环境的污染也越来越严重，并且降解多环芳烃又十分的难完成。如果接触多环芳烃的太久还可能会对动物和人类的皮肤、造血、神经，免疫和生殖系统产生影响。它可以导致基因发生突变，并且使人们患癌症的几率大大增加。因此对多环芳烃的降解进行研究有着十分重大的意义。

萘在环境中的分布十分普遍，是多环芳烃相对分子质量最小，结构最简单的物质，它具有两个苯环结构，通常是用来研究多环芳烃降解的典型化合物。萘的固液分配比系数较高并且水溶性较低所以它能够抵抗微生物的利用。而生物降解效率高，所需要的成本较低且不会产生二次污染物。

1.2 国内外研究现状

多环芳烃在环境中随处可见，而它对人类的生命健康又有着巨大的危害。因此，长期以来，美国环境保护局（US EPA）一直把控制多环芳烃优先放在有机污染物的黑名单中[2]。这种污染物由于其非常低的水溶性和对海洋沉积物较强的吸附力,因此在环境中普遍存在，造成严重的环境问题，而环保问题早已成为人们日益关注的焦点。汽车尾气中萘的含量与车型、车况、燃油类型等有关，杭州的调查显示不同车辆尾气中萘的浓度在6.217～13.19g/m³。消除环境中的多环芳烃是科研人员为之奋斗的核心，也是国内外研究的热点，环境中的多环芳烃可以通过许多方法进行去除，包括挥发、光氧化、化学催化、生物累积、微生物降解和吸附作用。化学催化法成本高，步骤繁琐，消耗时间较长，需要投入大量人力、物力等缺点，不被广泛使用。而微生物降解由于具有操作简单、处理费用低、不产生二次污染等优点,成为清除多环芳烃污染的主要手段。微生物降解法可满足人们对多环芳烃降解的要求，它效率高，成本低，环境友好且无二次污染。

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