论文总字数：23854字

摘 要

随着化石资源的枯竭，由化石原料化学合成有机酸已无法满足工业需求。目前，利用微生物发酵法合成有机酸是一种有效的方法。产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes，简称A. succinogenes）是一种革兰氏阴性兼性厌氧菌，底物利用谱广泛，被认为是最具产业化生产前景的琥珀酸生产菌株，但其琥珀酸的合成机制尚不明晰。

本课题在前期构建的重组菌株A. succinogenes ΔpflA基础上，考察了原始菌株130Z与重组菌株ΔpflA 在厌氧发酵、有氧发酵和有氧-厌氧两阶段发酵三种不同发酵策略下其细胞生长、产物合成以及相关基因表达水平的变化，分析了丙酮酸甲酸裂解酶激活酶（pflA）的缺失对产琥珀酸放线杆菌产物合成及代谢通路的影响。结果发现在厌氧条件下ΔpflA菌株中ldh的表达水平比野生型菌株高2.3倍，表明乳酸生物合成途径被激活；在有氧条件下ΔpflA菌株的丙酮酸激酶（pk），丙酮酸甲酸裂解酶（pfl）和乙酸激酶（ack）基因的表达水平相对于野生型菌株显著增加，乙酸产量可达34.92±1.36 g/L，表明乙酸生物合成途径被激活；对于有氧-厌氧两阶段发酵，ΔpflA菌株中所有基因表达水平相对于野生型均有显著增加，乳酸脱氢酶（ldh）的转录水平提高了近85倍，琥珀酸和乳酸的积累能力增加，分别可达38.82±1.15 g/L和43.05±0.96 g/L，比原始菌株分别提高了1.3倍和11倍。这些结果表明，A. succinogenes不仅是琥珀酸的天然生产菌株，还可能是乙酸和乳酸生物合成的优良菌株。

关键词：产琥珀酸放线杆菌、琥珀酸、两阶段发酵、丙酮酸甲酸裂解酶激活酶

ABSTRACT

With the depletion of fossil resources, the chemical synthesis of organic acids from fossil materials cannot meet the industrial demand.At present, microbial fermentation is an effective method to synthesize organic acids from renewable carbon sources rather than fossil materials.Actinobacillus succinogenes (A. succinogenes) is A gram-negative anaerobe, and its substrate is widely used, so it is considered as the most promising succinic acid producing strain, but the synthesis mechanism of succinic acid is still unclear.

This topic in the early construction of the recombinant strains of A. succinogenes ΔpflA basis, examines the original strain 130 z and recombinant strains ΔpflA in anaerobic fermentation, aerobic, anaerobic and aerobic fermentation, two-phase fermentation under three different fermentation strategy to the cell growth, synthesis, and the change of the related gene expression level, analyzes the pyruvic acid formic acid decomposition enzyme activation (pflA) lack of succinic acid production actinobacillus synthesis and the effect of metabolic pathways.Found that under the condition of anaerobic ΔpflA strains in expression of ldh level 2.3 times higher than the wild type strains and showed that lactic acid biosynthetic pathway is activated.Under aerobic conditions ΔpflA strain of pyruvate kinase (pk), pyruvate formate lyase (pfl) and acetate kinase (ack) gene expression level increased significantly compared with wild type strain, acetic acid yield is up to 34.92±1.36 g/L, show that acetic acid biosynthetic pathway is activated.For two stage aerobic, anaerobic fermentation, ΔpflA all gene expression in the strain levels were significantly increased compared with wild type, lactate dehydrogenase (ldh) transcription level increased nearly 85 times, succinic acid and lactic acid accumulation ability increase, respectively of 38.82±1.15 g/L and 43.05±0.96 g/L,1.3 times and 11 times.These results indicated that A. succinogenes was not only A natural succinogene producing strain of succinic acid, but also possibly an excellent strain of acetic acid and lactic acid biosynthesis.

Key words:Actinobacillus succinogenes，Succinic acid，Two-stage fermentation，pflA

目录

第一章 文献综述 1

1.1 背景介绍 1

1.2 产琥珀酸放线杆菌(A. succinogenes)简介 1

1.3 A. succinogenes代谢途径介绍 1

1.4 产琥珀酸放线杆菌代谢工程研究进展 3

1.4.1 基因敲除技术介绍 3

1.4.2 A. succinogenes重组菌株ΔpflA 4

1.5 A. succinogenes的底物利用极其产酸能力 5

1.6 A. succinogenes的产物--琥珀酸介绍 6

1.7 本论文的主要内容 6

1.8 本论文的研究意义 7

第二章 实验材料与方法 8

2.1 菌种 8

2.2 实验试剂 8

2.3 实验器材 9

2.4 培养基 10

2.5 培养方式 11

2.5.1种子培养（厌氧） 11

2.5.2摇瓶发酵（厌氧） 11

2.5.3发酵罐发酵 11

2.6 分析检测方法 12

2.6.1葡萄糖含量的测定 12

2.6.2有机酸及其他产物的测定 12

2.6.3总RNA的提取 12

2.6.4去除基因组DNA 12

2.6.5引物 13

2.6.6实时荧光定量 PCR 13

2.6.7 Real-Time PCR实验结果分析 14

2.6.8 酶活的测定 14

第三章 实验结果与讨论 15

3.1厌氧条件下原始菌株130Z与重组菌株△pflA发酵性能的比较 15

3.1.1 摇瓶厌氧发酵 15

3.1.2 5L发酵罐厌氧发酵 15

3.1.3 厌氧条件下相关基因的转录水平分析 18

3.1.4 酶活的测定 18

3.1.5小结 19

3.2 有氧条件下原始菌株130Z与重组菌株△pflA发酵性能的比较 19

3.2.1 发酵罐有氧发酵 19

3.2.2 有氧条件下相关基因的转录水平分析 22

3.3 有氧-厌氧两阶段条件下原始菌株130Z与重组菌株△pflA发酵性能的比较 22

3.3.1 发酵罐有氧-厌氧两阶段发酵 22

3.3.2 有氧-厌氧两阶段条件下相关基因的转录水平分析 25

3.4 原始菌株与重组菌株在三种发酵条件下基因表达水平分析 26

展望 28

参考文献 29

致谢 32

第一章 文献综述

• 1. 背景介绍

生物生产的工业化始于1919年查尔斯·辉瑞公司生物合成的柠檬酸^[1]。与化学合成法相比，生物法生产有机酸具有环境污染小、原料成本低、发酵条件温和以及高效率等优势^[2]。随着生物合成技术的发展，生物制品在人类社会的许多方面得到了广泛的应用，包括食品、制药、冶金和石油化学等工业。

• 1. 产琥珀酸放线杆菌(A. succinogenes)简介

1. succinogenes是目前发现所有细菌中产琥珀酸的能力最高的，最早来自牛瘤胃内容物，是从中分离得到的一种革兰氏阴性兼性厌氧菌^[3]。

产琥珀酸放线杆菌被认为是最有希望工业化生产琥珀酸^[4]的生物之一。A. succinogenes具有将戊糖和己糖转化为琥珀酸的天然能力，在厌氧环境中可以利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖、甘露醇、木糖等广泛的原料作为碳源^[5]。同时，产琥珀酸放线杆菌也是一种耐渗透压菌，较温和，具有特殊的产酸能力，可适应高浓度葡萄糖的环境，有利于发酵。产琥珀酸放线杆菌可固定CO₂生成琥珀酸。此外，A. succinogenes在有氧-厌氧两阶段发酵^[6]条件下能产生高浓度的乳酸，有氧-厌氧两阶段法的乳酸脱氢酶活性比单相法高18倍，乳酸产量增加32倍，最终浓度为135.6 g/ L^[6]。

因此，产琥珀酸放线杆菌是将木质纤维素糖和CO₂转化为可再生原料的新兴生物制品的理想候选者。

• 1. A. succinogenes代谢途径介绍

从目前对A. succinogenes发酵产琥珀酸的整个代谢途径的研究中得知，A. succinogenes有糖酵解途径和磷酸己糖旁路的关键酶，其中PCK、MDH、FUM这三种酶的活性及浓度在整个代谢途径中是极显著的。Guettler研究发现琥珀酸的产率取决于关键酶的酶活力、CO₂浓度和电子还原力^[7]。Kim等人后研究发现，PCK的增加会提高SA的产量^[8]。McKinlay等^[9]为了研究SA代谢途径，利用¹³C原子来标记代谢中间产物中的位置，实验结果表明PEP是整个代谢途径中一个十分关键的节点。A. succinogenes代谢途径如图1-1：

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