论文总字数：18583字

摘 要

以可再生原料为底物，通过厌氧发酵制备丁酸丁酯是生物炼制的热点之一。此课题以葡萄糖作为碳源，以丙酮丁醇梭菌NJ4和酪丁酸梭菌为主要菌种，构建了产丁酸丁酯混菌共培养体系，消除了丙酮丁醇梭菌NJ4和酪丁酸梭菌合成丁酸丁酯需要外源添加前体物（丁醇/丁酸）的问题。在后续优化中考虑了发酵萃取剂、混菌时间、混菌比例、混菌pH值及分批补料对丁酸丁酯产量的影响。确定了最优发酵条件为：以十二烷为萃取剂，丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌以3:2的比例同时接种，pH调控为6.0时，丁酸丁酯产量最高，产量为15.11 g/L，收率为0.25 g/g。当初糖浓度为60 g/L，在72h时进行分批补料，补加葡萄糖至60g/L，在192 h时丁酸丁酯产量到达峰值，为34.42g/L，收率为0.33 g/g。

关键词：丙酮丁醇梭菌 酪丁酸梭菌 丁酸丁酯 混菌发酵

ABSTRACT

The production of butyl butyrate by anaerobic fermentation using renewable raw materials as substrates is one of the hot spots in biorefinery. In this project, butyl butyrate was produced from glucose using co-cultivation of Clostridium acetobutylicum NJ4 and C. tyrobutyricum, which was able to eliminate the problem of butyl butyrate biosynthesis requiring the addition of precursors (butanol/butyric acid). In the subsequent optimization, the effects of extractant, mixed-time, strain ratio and pH were considered. The optimal fermentation conditions were determined as follows: dodecane was used as the extractant, C. acetobutylicum and C. tyrobutyricum were inoculated simultaneously at a ratio of 3: 2. When the pH was adjusted to 6.0, the highest butyl butyrate of 15.11 g/L was obtained with a yield of 0.25 g/g. When the initial glucose concentration was 60 g/L, batch feeding was performed at 72 h with glucose added to 60 g/ L. The highest butyl butyrate of 34.42 g/L was produced, with a yield of 0.33 g/g.

Key words: Clostridium acetobutylicum; Clostridium tyrobutyricum; butyl butyrate; co-cultivation

目录

摘要 2

ABSTRACT 3

引言 5

第一章 文献综述 6

1.1 丁酸丁酯 6

1.1.1. 丁酸丁酯的理化性质 6

1.1.2. 丁酸丁酯的制备方法 6

1.1.3. 丁酸丁酯的应用 8

1.2 混菌 8

1.2.1. 混菌发酵 8

1.2.2混菌发酵的优势 9

1.2.3 混菌发酵的挑战与局限 10

第二章 材料与方法 12

2.1. 材料 12

2.1.1. 菌株 12

2.1.2. 实验试剂 12

2.1.3. 实验器材 14

2.1.4.培养基 15

2.2. 实验方法 15

2.2.1. 丙酮丁醇梭菌NJ4培养方法 15

2.2.2. 酪丁酸梭菌培养方法 15

2.2.3. 混菌方法 16

2.2.4. 检测方法 16

2.2.4.1. 发酵液中葡萄糖浓度通过测糖仪检测 16

2.2.4.2. 挥发性有机酸和丁酸丁酯浓度的测定 16

2.3. 课题来源及研究内容 17

2.3.1. 课题来源 17

2.3.2. 研究内容 17

第三章 结果与讨论 18

3.1. 混菌发酵单因素优化 18

3.1.1. 萃取剂的优化 18

3.1.2. 接种时间的优化 19

3.1.3. 混菌接种比例的优化 21

3.1.4. 培养基pH的优化 22

3.1.5. 分批补料 24

第四章 结语与展望 25

4.1. 结语 25

4.2. 展望 25

参考文献 27

致谢 30

引言

丁酸丁酯广泛应用于食品、溶剂、化妆品、香水和制药等行业，因其具有独特的水果气味，类似于香蕉和菠萝，所以作为香料化合物应用广泛。传统酯化反应合成丁酸丁酯存在设备腐蚀严重，合成过程副反应多，合成过程中产生的废酸污染环境等问题。利用脂肪酶催化合成丁酸丁酯，产品纯度高，然而收率较低、底物和酶成本较高，限制了其大规模应用。因此，迫切需要开发新型生产工艺，实现丁酸丁酯的高效合成。生物发酵法合成丁酸丁酯能以可再生的生物质为原料，具有反应条件温和、产品纯度高、过程绿色环保等优势。

第一章 文献综述

1.1 丁酸丁酯

1.1.1. 丁酸丁酯的理化性质

丁酸丁酯分子式为C₈H₁₆O₂，结构式CCCCOC(=O)CCC，相对分子质量为143.204。丁酸丁酯常温下外观与性状呈无色透明液体状态，具有菠萝和香蕉气味。熔点为-91.5℃，沸点大小为166.6℃，相对密度（水＝1）为0.8709，折射率1.4075，闪点53℃，溶解性：不溶于水，易溶于有机溶剂，例如乙醇、乙醚等。化学性质较为稳定，丁酸丁酯在弱酸性介质中较稳定，不导致变色，但在碱性介质中不稳定，易分解，易燃，具有刺激性。

1.1.2. 丁酸丁酯的制备方法

1.1.2.1. 丁酸丁酯的化学制备

目前，大多数酯(R₁COOR₂)是通过费歇尔酯化法生产的，其中有机酸R₁COOH和醇R₂OH在高温(200-250℃)下反应并被无机催化剂(例如硫酸)催化。然而，高温下腐蚀性酸/碱造成的危险条件和化石燃料日益稀缺(醇和羧酸的来源)限制了这些酯的大量生产。

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