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摘 要

目前蔗糖生物传感器大多数是以蔗糖酶、变旋酶、葡萄糖氧化酶三种酶元件共同固定为开发策略，但多酶共固定效率低也是限制蔗糖生物传感器开发的主要因素。因此，开发一种有效的多酶定向固定策略对于蔗糖生物传感器具有十分重要的研究意义。本课题基于强亲和作用的亲和素-生物素系统对蔗糖酶、变旋酶及葡萄糖氧化酶进行三酶连接，并借助于化学交联于载体表面的亲和素分别采取逐层组装定向固定、不同pH条件下多酶一次性固定的两种不同方式以达到酶元件定向共固定的效果。与空白对照组相比较，生物素标记及基于亲和素-生物素系统三酶连接后多酶相对活性分别为98 % 和70 %，因此不会对酶本身造成较多的负面影响，酶活损耗较少。但后续基于化学交联于载体表面的亲和素采取逐层组装定向固定后多酶的相对活性为10 % ，在不同pH条件下多酶一次性固定后多酶相对活性分别为36 % 、47 % ，酶活显著降低，存在酶空间构象破坏、单层固定化效率低等原因。因此，基于亲和作用的亲和素-生物素系统不适用于蔗糖生物传感器的三酶元件共固定，酶元件固定化过程中酶活损耗较大，固定化效果不理想。

关键词：生物素 亲和素 酶 蔗糖生物传感器 定向固定化酶

Immobilization of sucrose sensor enzyme based on affinity connection

Abstract

At present, most sucrose biosensors are based on the joint fixation of invertase, glucose oxidase and invertase, but the low efficiency of multi-enzyme co-fixation is also the main factor limiting the development of sucrose biosensors. Therefore, it is of great significance to develop an effective multi-enzyme directed fixation strategy for sucrose biosensors. This topic is based on the strong affinity of avidin biotin system for sucrase, mutarotation enzyme and three glucose oxidase enzyme connection, and by means of chemical crosslinking on the carrier surface avidin respectively take directional fixed under different pH conditions, step by step assembly enzyme one-time fixed in two different ways to achieve the effect of enzyme element orientation were fixed. Compared with the blank control group, the relative activity of multiple enzymes in biotin-labeled and avidin-biotin-based trienzyme ligation was 98% and 70%, respectively, so it would not have much negative effect on the enzyme itself, and the enzyme activity loss was less. However, the enzyme relative activity of the subsequent affinavidins on the surface of the carrier based on chemical cross-linking was fixed layer by layer, and after one-time fixation of multiple enzymes under different pH conditions, the relative activity of multiple enzymes was respectively 36% and 47%, and the enzyme activity was significantly reduced, resulting in the destruction of enzyme conformation and low efficiency of monolayer immobilization. Therefore, the avidin-biotin system based on affinity is not suitable for the co-fixation of the three enzyme elements of the sucrose biosensor. The enzyme activity loss during the immobilization of the enzyme element is large, and the immobilization effect is not ideal.

KEYWORDS：biotin; avidin; enzyme; sucrose biosenson; immobilized enzyme

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1引言 1

1.2多酶固定化技术 2

1.3 亲和作用定向固定化酶 3

1.3.1 生物素-亲和素系统（BAS） 3

1.3.2 生物素-亲和素系统（BAS）的结合原理 4

1.3.3 生物素-亲和素（BAS）系统的特点 4

1.4 生物传感器 5

第二章 材料与方法 6

2.1实验材料 6

2.1.1 实验试剂 6

2.1.2 实验器材 7

2.1.3 实验菌株及培养 7

2.2 实验方法 9

2.2.1 合成关键基因表达载体的构建 9

2.2.2 蛋白表达工程菌的构建 9

2.2.3 关键酶的表达 9

2.2.4 蛋白的纯化及聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 9

2.3 生物素标记 10

2.4 生物素-亲和素进行三酶连接 10

2.4.1 层层组装三种酶 10

2.4.2 相对酶活的测定 10

2.5 基于载体的三酶逐层定向组装 11

2.5.1 层层定向组装三种酶 11

2.5.2 相对酶活测定 11

2.6 不同pH条件下一次性定向固定 12

2.7 壳聚糖固定 12

第三章 结果与讨论 13

3.1 重组酶的表达 13

3.2 生物素标记GOD、MUT、INV的研究 14

3.3 层层组装三种酶的研究 15

3.4 基于载体层层定向固定对酶活的影响 16

3.5 不同pH条件下多酶一次固定对酶活的影响 17

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致谢 22

第一章 绪论

1.1引言

高效性和专一性是酶作为催化剂最为突出的特点，但其在反应过程中具有不稳定性，容易被蛋白酶降解且催化反应单一^[1]，这成为酶在催化反应过程的主要限制因素。因此找到一种提高酶的稳定性、使酶有效参与催化反应的方法十分重要，而固定化酶可有效解决这一问题^[2]。

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