论文总字数：20421字

摘 要

常规的酶固定化方法都是随机的固定化，这种固定化往往存在酶活不高的情况。因此，调控载体界面使之与酶分子的界面特性相匹配就显得尤为重要。这篇论文旨在以经过基因工程改造而带有组氨酸标签的腺苷酸环化酶（AC）为模式酶，以氧化石墨烯（GO）作为载体，通过亲和固定化研究载体界面修饰对固定化腺苷酸环化酶催化性能的影响，为工业化生产环磷酸腺苷（cAMP）提供基础理论支持。主要研究内容如下：

（1）通过PDA/PEI共沉积柔性链修饰氧化石墨烯（GO），再通过戊二醛将Ni² -NTA共价连接到功能化GO的表面，最后将所得载体用于具有His标记的腺苷酸环化酶（AC）的固定化。

（2）通过FT-IR、FE-SEM和AFM等表征手段分析功能化GO的组成与结构，亲和固定化AC提供理论依据。

（3）通过研究氨基柔性链修饰GO对固定化AC催化性能的影响，确定最佳的载体制备条件以及固定化条件

关键词：腺苷酸环化酶 亲和固定化 氧化石墨烯 柔性链修饰

Abstract

The traditional methods of enzyme immobilization belong to random immobilization, which often has low enzyme activity. Therefore, it is particularly important to regulate the carrier interface to match the interfacial properties of enzyme molecules.This paper aims to use adenylate cyclase (AC) with histidine label as the model enzyme and graphene oxide (GO) as the carrier to study the effect of carrier interface modification on the catalytic performance of immobilized adenylate cyclase through affinity immobilization, which provides basic theoretical support for the industrial production

(1) Modification of graphene oxide (GO) by PDA/PEI co-deposition of flexible chains and Ni² -NTA covalently attached to the surface of the functionalized GO, the resulting carrier was used for immobilization of adenylate cyclase (AC) with His markers.

(2) Analyse the composition and structure of functional GO by means of characterization such as FT-IR 、FE-SEM and AFM.

(3) By studying the influence of the modified GO of amino flexible chain to determine the optimum conditions of preparation and immobilization of the immobilized AC .

Keywords: Adenylate cyclase; Affinity immobilized; Graphene oxide; Flexible modification

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 环磷酸腺苷 1

1.2 腺苷酸环化酶 1

1.3 酶的固定化 1

1.3.1 吸附法 2

1.3.2交联法 2

1.3.3包埋法 2

1.3.4共价键结合法 3

1.4 酶的亲和固定化 3

1.4.1 亲和固定法的优势 3

1.4.2 亲和固定化的方法 3

1.5 亲和固定化介质 4

1.6 PDA/PEI共沉积 4

第二章 氨基柔性链对GO表面性质的调控 7

2.1 主要实验试剂 7

2.2 主要实验仪器 7

2.3 实验方法与实验步骤 7

2.3.1 氨基柔性链修饰氧化石墨烯的制备 7

2.3.2 载体的制备 8

2.3.3 固定化酶的制备 9

2.3.4 表面结构性质表征 9

2.4 结果与讨论 10

2.4.1 PDA以及PDA/PEI自聚过程中全波长扫描分析 10

2.4.2 氨基柔性链改性后GO的FE-SEM表征 10

2.4.2 氨基柔性链改性后GO的AFM表征 11

2.4.3 氨基柔性链改性后GO的FTIR表征分析 12

2.4.5 不同改性方法对固定化AC活力的影响 13

2.5 本章小结 14

第三章 氨基柔性链修饰GO对固定化AC催化性能的影响 15

3.1 主要实验试剂 15

3.2 主要实验仪器 15

3.3 实验方法与步骤 15

3.3.1 酶活力以及蛋白载率测定 15

3.3.2 蛋白含量-吸光度标准曲线的测定 16

3.4 结果与讨论 17

3.4.1 载体制备条件优化 17

3.4.2 AC固定化过程中条件的优化 18

3.4.3 固定化酶的温度以及pH耐受性 19

3.4.4 固定化酶的储存稳定性以及可重复利用性 20

3.5 本章小结 20

第四章 结论与展望 21

4.1结论 21

4.2 展望 21

参考文献 22

致谢 25

第一章 文献综述

酶的本质是一类蛋白质，它存在于人类社会的方方面面，其特点是对其底物具有着高度的催化功能。随着当今科技的不断发展，能源的短缺以及环境的恶化，一场主题为工业生物技术的革命正席卷全球，而酶作为生物催化的主要角色，引领着革命的浪潮。

1.1 环磷酸腺苷

环磷酸腺苷（cAMP）是人体不可或缺的物质，具有调节人体生理激素的功能，其分子式为C₁₀H₁₂N₅O₆P，可溶于水，难溶于乙醇、乙醚，化学性质稳定^[1]。

图1-1 cAMP的结构图

1.2 腺苷酸环化酶

腺苷酸环化酶(AC)属于一种代谢催化剂，它是人体维持生理功能的重要物质,是生产cAMP的关键酶。根据来源的不同，可将AC分为六大类。第二类以及第三类AC的催化机制已有研究，二者具有相同的催化机制，如下图1-2所示：两个Mg² 结合在腺苷酸环化酶的两个天冬氨酸（Asp）上，一个Mg² 激活ATP的3'-OH，利于之后对α-磷酸基团的进攻，另一个Mg² 用来稳定脱下的焦磷酸基团。

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