论文总字数：20843字

摘 要

石斛碱最早从金钗石斛中分离得到，具有复杂氮杂环结构，是金钗石斛主要的特征生物碱。具有止痛解热、降低心率、降低血压、降低血糖等药理作用，因而，具有较高的药用研究价值。石斛碱的获取方法主要有直接提取法，化学合成法，植物细胞或组织培养提取法，微生物发酵法等。金钗石斛鲜条和原球茎的石斛碱含量较低，直接从植物组织中提取石斛碱，远远不能满足科研和市场的需求。目前利用微生物发酵产石斛碱是一项比较热门的研究，通过菌株筛选，基因诱变得到能产较高石斛碱的菌株，将菌株在合适的条件下进行发酵培养，从而得到含有较高石斛碱含量的内生真菌代谢产物。

本课题采用三角瓶模拟固液耦合发酵培养过程，通过对液态发酵的种子液接种量和固体发酵含水量等因素的研究，初步探索内生真菌MD33的固液耦合发酵体系，以期为后续的发酵罐培养提供参考。通过观察MD33种子液在液体发酵培养基中的生长状态和石斛碱含量测定，确定种子液的最佳接种量和液体培养基最佳转移时间；通过观察三角瓶中MD33菌丝体的生长状态和产孢子情况确定固体发酵培养基的最佳含水量。结果表明：液态发酵的种子液接种量为4%时，石斛碱合成量最高，为0.3620 µg/g；菌丝体在液体培养基中发酵培养3~4 d 左右时，生长状态最好，适宜转入固体发酵培养基中继续培养。固体发酵培养基的最佳含水量为40%时，菌体长势最好，3 d 左右固体培养基顶部菌丝就已产出孢子。另外，种子液发酵培养14 d后，MD33菌株也会产石斛碱，石斛碱含量一般在0.15~0.18 µg/g。

关键词：石斛碱；内生菌MD33；固液耦合发酵；接种量；含水量

Research on dendrobium production by solid-liquid coupling fermentation of endophytic fungi

Abstract

Dendrobium was first isolated from dendrobium nobilis. It has complex nitrogen heterocyclic structure and is the main characteristic alkaloid of dendrobium nobilis.It has pharmacological effects such as analgesia and antipyretic, lowering heart rate, lowering blood pressure and lowering blood glucose, etc. Therefore, it has high medicinal value. The main methods to obtain dendrobium are direct extraction, chemical synthesis, plant cell or tissue culture extraction, microbial fermentation and so on.The content of dendrobium in fresh strips and protocorm of dendrobium chinensis is low, and the direct extraction of dendrobium from plant tissues is far from meeting the needs of scientific research and market.At present, the use of microbial fermentation to produce dendrobium is a popular research, through strain screening, gene mutagenesis to obtain a high dendrobium strains, strains under the appropriate conditions for fermentation and culture, so as to obtain endophytic fungal metabolites containing high dendrobium content.

In this study, a triangular bottle was used to simulate the solid-liquid coupling fermentation and culture process, and the solid-liquid coupling fermentation system of endophytic fungus MD33 was preliminarily explored by studying the seed liquid inoculation amount of liquid fermentation and the water content of solid fermentation.This study can provide reference for the subsequent fermentation tank culture. By observing the growth state of MD33 seed liquid in the liquid fermentation medium and the determination of the final dendrobium content, the optimal inoculation amount of seed liquid and the optimal transfer time of liquid medium were found. The optimum water content of solid fermentation medium was determined by observing the growth state and spore production of MD33 mycelium in the triangle bottle. The results showed that the highest dendrobium synthesis was 0.3620 µg/g when the inoculation amount of liquid fermentation seed liquid was 4%. When mycelium was fermented and cultured in liquid medium for 3~4 days, the growth state was the best and it was suitable to be transferred into solid fermentation medium for continuous culture. When the optimal water content of the solid fermentation medium was 40%, the bacteria grew best, and the mycelia on the top of the solid medium produced spores at about 3 days. In addition, after 14 days of seed liquid fermentation culture, MD33 strain will also produce dendrobium, dendrobium content is generally in the range of 0.15~0.18 µg/g.

Keywords: dendrobium；endophyte MD33；solid-liquid coupling fermentation,；inoculation quantity； water content

目录

内生真菌固液耦合发酵产石斛碱的研究 I

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1金钗石斛碱概述 1

1.1.1金钗石斛的生物学特性 1

1.1.2金钗石斛主要成分 1

1.1.3石斛碱的药理作用 2

1.2植物次生代谢物的生产方法 2

1.3液态发酵和固态发酵的介绍及其特点 3

1.4发酵产物生物量的测定 3

1.4.1液态发酵产物的生物量测定方法 3

1.4.2 固态发酵产物的生物量测定方法 4

1.5本论文的主要研究内容 4

第二章 金钗石斛内生菌MD33固-液耦合发酵 5

2.1实验材料与试剂 5

2.1.1实验材料 5

2.1.2实验试剂 5

2.1.3实验器材 6

2.2实验方法 7

2.2.1菌种活化 7

2.2.2种子液制备 7

2.2.3 内生真菌形态观察 7

2.2.4紫外比色法的方法学验证 8

2.2.5种子液中石斛碱的提取与检测方法 8

2.2.5不同接种量对液体发酵的影响 9

2.2.6 菌体生物量的测定 10

2.2.7液体发酵石斛碱含量测定 10

2.2.8 不同含水量对固体发酵的影响 10

第三章 结果与讨论 12

3.1 菌体PDA平板上的培养情况 12

3.2MD33菌体在PD液体培养基中的生长情况 13

3.3内生真菌形态观察 14

3.4紫外方法学验证结果 15

3.5 PD培养基发酵产物生物量与石斛碱含量测定 16

3.5.1 PD培养基培养14d后菌液的pH变化 16

3.5.2 干重法测PD培养基中发酵产物生物量结果 17

3.5.3 石斛碱含量测定结果 18

3.6 不同接种量对液体发酵的影响 19

3.6.1 不同接种量对菌液pH的影响 19

3.6.2 不同接种量对MD33液体发酵产物生物量的影响 21

3.6.3 不同接种量对MD33产石斛碱的影响 21

3.7 不同含水量对固态发酵的影响 22

第四章 结论与展望 24

4.1 结论 24

4.2 展望 26

参考文献 27

致谢 29

第一章 绪论

1.1金钗石斛碱概述

1.1.1金钗石斛的生物学特性

金钗石斛为多年生草本植物，具有附生性，喜生长于阴湿环境^[1]，最适生长温度在18-21℃，因而，金钗石斛多生长在热带和亚热带地区^[2]，海拔480-1700 m的山林中树干上或山谷岩石上。在我国主要分布在华南地区^[1]。

1.1.2金钗石斛主要成分

金钗石斛中化学成分丰富，以生物碱、多糖、酚类、香豆素、甾体等^[3]为主，其中，石斛碱是金钗石斛的主要特征成分，也是最早分离出并进行结构鉴定的化合物^[4]（石斛碱结构如图1-1）。近些年来，金钗石斛中的总生物碱相关研究更加细致，研究发现金钗石斛中生物碱成分丰富^[5]且较其他品种多，主要为石斛碱及其衍生生物碱如：金石斛碱、石斛副碱、石斛次碱、6-羟基石斛碱、N-甲基石斛季铵碱、N-异戊烯基石斛季铵碱等24种^[6]。含量测定表明，金钗石斛茎的上段中含有的有效成分含量最高^[7]；在茎中部氨有机物含量最小；茎的下部有效成分的含量有高有低，与中、上部呈相似分布，仍可药用^[7]。据文献报道，金钗石斛茎中生物碱的总含量约0.3%，栽培品中仅石斛碱含量即可达0.2%^[8]。

请支付后下载全文，论文总字数：20843字