摘 要

近年来, 自组装的PEG-PCL、PEG-PLGA、PEG-PDLLA嵌段聚合物胶束因其既能增加药物在体内外的稳定性，增加疏水性药物的溶解性，又能改善药物分子的传递性能等优势，而备受人们的关注。目前，有关这些嵌段聚合物胶束对CYP450酶的诱导作用尚未见研究报道。本文以载体材料PEG-PCL、PEG-PLGA和PEG-PDLLA为研究对象，采用薄膜分散法制备成空白纳米胶束，并对其表征。分别以非那西丁（Phenacetin，PN）、盐酸安非它酮（Bupropion hydrochloride ，BUP）、双氯芬酸（Diclofenac，DCF）、咪达唑仑（Midazolam ，MDZ）作为酶的探针底物，以大鼠原代肝细胞为实验模型，采用底物探针法将空白胶束溶液与相应的底物药物共同孵育，通过LC-MS/MS检测底物的代谢产物的量考察四种嵌段共聚物对大鼠肝CYP1A2、CYP2B1、CYP2C6、CYP3A1/2这四种酶的诱导作用，为聚合物纳米载体系统的设计和合理应用提供参考。

实验结果表明，制备的胶束粒径分布均一，稳定性良好，在体外对大鼠原代肝细胞CYP1A2、CYP2B1、CYP2C6、CYP3A1/2酶有不同程度的诱导作用，且其作用程度有一定的规律性。这对了解PEG-PCL、PEG-PLGA、PEG-PDLLA嵌段聚合物胶束载体系统对药物的体内药动学规律的影响以及胶束载体安全性具有指导意义。

关键词：PEG-PCL；PEG-PLGA；PEG-PDLLA；CYP450酶；原代大鼠肝细胞

Abstract

Over the past decades, it has been paid much attention to the self-assembled from PEG-PCL, PEG-PLGA, PEG-PDLLA block copolymer micelles for their not only increasing the stability of the drug in vivo and the solubility of hydrophobic drugs, but also improving the transmission performance of drug molecules and other advantages. At present, the induction of these block copolymer micelles carrier on CYP450 activity has not been reported. In this study, a new type of drug carrier material PEG-PCL, PEG-PLGA and PEG-PDLLA is prepared into blank micelles by thin-film dispersion and characterized. In addition, setting Phenacetin (PN), Bupropion hydrochloride (BUP), Diclofenac (DCF), Midazolam (MDZ) as the enzyme probe substrates, respectively and primary rat hepatocytes as experimental model systems, to incubate blank block copolymer micelle with the corresponding substrates, these induction effects of PEG-PCL copolymer micelles on CYP1A2, CYP2B1, CYP2C6, CYP3A1/2 four liver enzymes were examined by the determination of metabolite production using LC-MS/MS to provide reference for the design and the rational use of polymeric nanocarriers system.

The results showed that micelles prepared in this experiment had uniform particle size and good stability; also induced CYP1A2, CYP2B1, CYP2C6, CYP3A1/2 enzymes in vitro rat primary hepatocytes in varying degrees, and the degree of activity had some regularities. It is instructive to understand the impact of PEG-PCL, PEG-PLGA, PEG-PDLLA block copolymer micelle carriers system for drugs in vivo pharmacokinetics law and micelle carrier safety.

Key Words：PEG-PCL; PEG-PLGA; PEG-PDLLA; CYP450 enzymes; primary rat hepatocytes

目 录

第1章 绪 论 1

1.1 研究背景与国内外综述 1

1.2 研究内容与方案 1

1.2.1 研究内容 1

1.2.2 研究方案 2

1.3 研究目的与意义 2

第2章 实验内容与方法 4

2.1 实验仪器与试剂 4

2.1.1 实验仪器 4

2.1.2 实验试剂 4

2.1.3 实验动物 5

2.2 四种嵌段共聚物胶束的制备 5

2.3 四种嵌段共聚物胶束的表征 6

2.3.1 临界胶束浓度（CMC）的测定 6

2.3.2 四种嵌段共聚物胶束粒径及Zeta电位的检测 6

2.3.3 四种嵌段共聚物胶束形态的观察 6

2.4 四种嵌段聚合物对原代大鼠肝细胞的毒性研究 6

2.4.1 样品溶液和试验溶液的配制 6

2.4.2 原代大鼠肝细胞提取与分离 7

2.4.3 MTT试验 8

2.4.4 乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（AKP）活性考察 8

2.4.5 数据处理及统计学分析 8

2.5 四种嵌段聚合物对大鼠肝CYP450酶诱导作用的研究 9

2.5.1 试验溶液的配制 9

2.5.2 四种嵌段共聚物对原代大鼠肝细胞CYP450酶的诱导作用 10

2.5.3 LC-MS/MS条件 10

2.5.4 数据处理及统计学分析 11

第3章 实验结果与分析 12

3.1 四种嵌段共聚物的表征 12

3.1.1 四种嵌段共聚物胶束的临界胶束浓度（CMC） 12

3.1.2 四种嵌段共聚物胶束的粒径及Zeta电位 13

3.1.3 四种嵌段共聚物胶束的形态 13

3.2 细胞形态学观察 14

3.3 四种嵌段共聚物对原代大鼠肝细胞的毒性研究 14

3.3.1 MTT试验 14

3.3.2 LDH试验 15

3.3.3 AST试验 16

3.3.4 ALT试验 17

3.3.5 AKP 试验 18

3.4 四种嵌段共聚物对大鼠肝CYP450酶诱导作用的研究 19

3.5 讨论 22

第4章 小结 24

参考文献 25

致 谢 27

第1章 绪 论

1.1研究背景与国内外综述

近年来，两亲性嵌段聚合物胶束因其既能增加药物在体内外的稳定性，增加疏水性药物的溶解性，又能改善药物分子的传递性能等优势，而常作为一种新兴的药物传递系统并备受人们的关注。两亲性嵌段聚合物胶束在溶液中可自发形成以疏水基团为内核, 亲水基团为外壳的“核-壳”型结构的分子有序聚集体^[1-3]。与表面活性剂相比，嵌段聚合物具有载药范围广、载药量高、性质稳定、生物相容性好等优点，因而具有比表面活性剂更广阔的临床应用前景^[4]。另外，嵌段聚合物胶束的粒径尺寸一般在100 nm以下，具有良好的组织渗透性；再加上拥有“隐身”特点的亲水性外壳，使其进入人体后可以躲避体内网状内皮系统（RES）的识别和吞噬，在体内滞留时间长，能够使药物有效地到达靶点并且具有控制药物释放的作用^[5,6]。因此，它常作为纳米药物载体用于靶向给药系统、蛋白质药物载体给药系统、基因治疗药物、难溶性药物和中药制剂等方面^[7]。目前，临床评估阶段或市场上所应用的嵌段共聚物主要有聚乙二醇-聚ε-己内酯(PEG-PCL)，聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)，聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)(PEG-PLGA)等^[8]。此外，一些载有紫杉醇的嵌段共聚物PEG-PDLLA胶束制剂Genexol^®-PM已处于临床前Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期研究阶段，用于乳腺癌、卵巢癌和头颈癌的治疗^[9]。因此，聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物拥有广阔的临床应用前景。

在临床和临床前的研究中，为保证形成的胶束具有较好的生物相容性和生物降解性，并符合临床应用要求，目前常用的亲水嵌段是分子量介于2000~5000的PEG，它可以延长药物载体的体内循环时间，减少免疫球蛋白的吸附，有效躲避网状内皮组织系统（RES）对药物载体的清除，并且价格便宜、毒性较小、且呈电中性及非免疫原性；常用的疏水段材料是PCL、PDLLA和PLGA，具有良好生物相容性、生物可降解性和毒性小等优点，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，被广泛用于生物医学领域和纳米^[10-12]。目前，PEG、PCL嵌段聚合物已经被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于人体内^[13]。PLGA也已经通过美国食品药品管理局（FDA）和欧洲药监局（EMA）认证，可用于人体使用的给药系统中^[14,15]。

1.2研究内容与方案

1.2.1研究内容

（1）制备并表征四种嵌段共聚物胶束（mPEG_2k-PCL_2k、mPEG_2k-PCL_5k、mPEG_2k-PDLLA_2k、mPEG_2k-PLGA_5k）；