摘 要

该研究收集墨旱莲及其混伪品4种，共23份样品，通过对其进行DNA（脱氧核糖核酸）提取和PCR（生物学的聚合酶链反应）扩增等操作，经注释后获得其ITS2序列，所得序列经Codoncode Aligner拼接后，采用MEGA5.1软件进行序列对比，计算种内和种间遗传距离（K2P），构建邻接树（neighbor-joing tree，NJ Tree）。结果表明墨旱莲ITS2序列种内变异均小于墨旱莲与其混伪品间的变异，种内最大遗传距离小于种间最小遗传距离，在NJ树上显示墨旱莲及其混伪品分别聚为独立的支。因此，ITS2序列作为DNA条形码可以鉴定墨旱莲及其混伪品，DNA条形码技术可为墨旱莲及其混伪品的鉴定提供新的方法。

关键词：墨旱莲；ITS2；DNA条形码；鉴定

Abstract

The study collected Eclipta and adulterants four kinds, a total of 23 samples, by extracting its DNA (deoxyribonucleic acid) and PCR (polymerase chain reaction biology) amplification and other operations, the comment after obtaining its ITS2 sequence, the sequence obtained after Codoncode Aligner splicing using MEGA5.1 software for sequence alignment, within the computing and interspecies genetic distances (K2P), constructed adjacent to the tree (neighbor-joing tree, NJ tree).The results showed that Eclipta ITS2 sequences within species variation were less than Eclipta its adulterants mix variation between the maximum genetic distance between species within species is less than the minimum genetic distance, displayed in the NJ tree Eclipta its adulterants were poly as an independent branch.Therefore, ITS2 sequence can be identified as DNA barcoding Eclipta and adulterants, DNA barcode technology can provide a new method for the identification of Eclipta and adulterants.

Keywords: Eclipta; ITS2; DNA barcode; Identification

目 录

第1章 绪论 1

1.1 药材简介 1

1.1.1 墨旱莲药材简介 1

1.1.2 元宝草药材简介 1

1.1.3 垂盆草药材简介 2

1.1.4 委陵菜药材简介 2

1.2 研究目的及意义 2

1.3 研究内容及目标 3

1.3.1 研究内容 3

1.3.2 目标 3

1.4 DNA条形码技术 4

1.4.1 DNA条形码技术的概念 4

1.4.2 DNA条形码技术的发展及优势 4

1.4.3 DNA条形码技术的国内外研究现状 4

第2章 药材的DNA条形码实验 6

2.1 实验原理 6

2.1.1 总DNA的提取 6

2.1.2 DNA检测 6

2.1.4 测序原理 7

2.2 实验耗材 7

2.2.1 实验药品及来源 7

2.2.2 仪器与试剂 9

2.3 实验方法 10

2.3.1 供试品处理 10

2.3.2 药品的配置 10

2.3.3 DNA的提取 11

2.3.4 样品DNA的保存 12

2.3.5 PCR扩增 12

2.3.6 琼脂糖凝胶电泳检测 13

2.3.7 测序 13

2.3.8 数据分析 13

2.4 数据分析及处理 14

2.4.1 墨旱莲及其混伪品种内变异分析 14

2.4.2 墨旱莲与混伪品种间变异分析 16

2.4.3墨旱莲与混伪品种间序列聚类分析 16

第3章 结论 18

参考文献 19

致谢 20

第1章 绪论

1.1 药材简介

1.1.1 墨旱莲药材简介

墨旱莲，中文学名，鳢肠Eclipta prostrata，又名旱莲草、墨水草、乌田草、乌心草等，是菊科鳢肠属的植物。一年生草本。茎直立，平卧或斜升，高60cm左右，通常自基部分枝，被贴生糙毛。叶长披针形或圆状披针形，无柄或有极短的柄，长3～10cm，宽0.5～2.5cm，顶端尖或渐尖，两面被密硬糙毛，边缘有细锯齿或有时仅波状。头状花序径6～8mm，细花序梗长2～4cm；总苞球状钟形，总苞片绿色，草质，5～6个排成2层，长圆形或长圆状披针形，内层比外层稍长，边缘及背面被白色短伏毛；外围的雌花2层，长2～3mm，舌状，舌片短，顶端2浅裂或全缘，中央的两性花多数，花冠管状，白色，长约1.5mm，顶端4齿裂；花托凸，有线形或披针形的托。托片中部以上有微毛；花柱分枝钝，有乳头状突起；瘦果暗褐色，长2.8mm，两性花的瘦果扁四棱形，雌花的瘦果三棱形，顶端截形，具1～3个细齿，基部稍缩小，表面有小瘤状突起，无毛，边缘具白色的肋。花期6～9月。常分布于全国各地的田边或路旁、河边等地，一般生长于海拔0m～1900m的地区，目前尚未由人工引种栽培。全草药用，有味甘酸，性凉，入肝肾二经，无毒。用于阴虚内热，血热妄行引起的吐血、尿血、衄血、咳血、崩漏出血、外伤出血及肝肾阴虚出现头晕目眩、牙齿松动、腰痛筋软、须发早白等。墨旱莲含有多种活性成分，如三萜皂苷类、噻吩类、黄酮类及香豆草醚类等，具有止血、保肝、免疫调节、抗炎、抗氧化、抗蛇毒、抗缺氧、抗衰老及保护心血管系统等多种药理活性。由于其强大的药用功效，已被中国药典收录^[1-2]。

1.1.2 元宝草药材简介

元宝草，又名合掌草、帆船草、上天梯、对月草、叫子草、叶抱枝、对经草、对月莲等，为金丝桃科金丝桃属植物元宝草Hypericum sampsonii Hance的全草。半常绿小灌木，可高达1m,全株光滑无毛。多分枝，圆柱形，红褐色，小枝对生。叶片长椭圆形，有透明腺点，长4～9cm，宽约1cm，顶端钝尖，全缘，基部渐狭稍抱茎，表面绿色，背面灰绿色，中脉显著，在背面稍凸起。花顶生，单生或成聚伞花序，直径3～5cm；小苞片披针形；花瓣5，宽倒卵形；萼片5，卵状椭圆形，顶端微钝；雄蕊花丝基部合生成5束，长约2cm；花柱细长，顶端5裂。蒴果卵圆形，花柱和萼片宿存。花果期6～8月。元宝草多生于坡地或路边杂草丛，我国南北各省均有分布。夏秋时节采收，洗净鲜用或晒干贮藏。性辛、苦，寒。该物种为中国植物图谱数据库收录的有毒植物，其毒性为全草有毒。元宝草同时也具有清热解毒，凉血止血，通经活络的功效。常用于治疗小儿高热，痢疾，衄血，吐血，肠炎，月经不调，白带等症；外用治外伤出血，跌打损伤，乳腺炎，烧烫伤，毒蛇咬伤等。民间常见用法为：3～5钱；外用适量，鲜品捣烂或干品研末敷患处。

1.1.3 垂盆草药材简介

垂盆草，又名狗牙草、狗牙瓣、石指甲、瓜子草等，为景天科植物垂盆草Sedum sarmentosum Bunge的全草。多年生肉质草本，夏、秋季采挖，除去杂质，晒干。其茎纤细，长可达500cm以上，部分节上可见纤细的不定根。叶3片轮生，叶片倒披针形至矩圆形，绿色，肉质，长1.5～2.5cm，宽0.3～0.5cm，先端近急尖，基部急狭，有距。花瓣5，长圆形或披针形，长约5～8mm，顶端外侧有长尖头；雄蕊10，比花瓣短；心皮5，稍稍开展。种子较为细小，呈现卵圆形，乳头在表面突起。花期一般在5～6月，果期一般在7～8月。垂盆草较耐寒，喜阴湿环境，常见于海拔1600m以下的向阳山坡、路旁湿润处、石隙和沟边。垂盆草具有利湿退黄，清热解毒的功效。常用于治疗湿热黄疸，小便不利，痈肿疮疡等症。一般服用15～30g。脾胃虚寒者慎服。

1.1.4 委陵菜药材简介

委陵菜Potentilla chinensis Ser，又名蛤蟆草、翻白草、天青地白、白头翁等，多年生草本。根粗壮，圆柱形，稍木质化。花茎上升或直立，高20～70cm，叶为羽状复叶，有小叶茎生叶托叶草质，边缘锐裂，绿色。伞房状聚伞花序，萼片三角卵形，花瓣黄色，宽倒卵形，顶端微凹，比萼片稍长；花柱近顶生。瘦果卵球形，深褐色，有明显皱纹。花果期4～10月。委陵菜常见于山坡草地、沟谷、林缘、灌丛或疏林下，分布在海拔400m～3200m。委陵菜因其根含鞣质，所以可用于提制栲胶；委陵菜具有清热解毒、止血、止痢的功效，其全草入药。嫩苗可以食用，一般用作猪饲料。委陵菜分布于中国多地、俄罗斯、日本、朝鲜^[1-2]。

1.2 研究目的及意义

墨旱莲(Ecliptae Herba)为菊科一年生草本植物鳢肠 Eclipta prostrata L.的干燥的地上部分，性寒，味甘、酸，具有滋阴护肾、凉血止血的功效，常用于治疗阴虚内热，血热妄行引起的吐血、衄血、咳血、尿血、崩漏出血、外伤出血，肝肾阴虚引起的头晕目眩、牙齿松动、须发早白、腰痛筋软等也常用到墨旱莲药材。墨旱莲含有多种活性成分，如三萜皂苷类、黄酮类、噻吩类及香豆草醚类等，具有止血、保肝、免疫调节、抗炎、抗蛇毒、抗缺氧、抗氧化、抗衰老及保护心血管系统等多种药理活性。由于其强大的药用功效，已被中国药典收录。墨旱莲药用价值高，市场需求量大，在销售中出现了大量的掺假品和混伪品^[3]，而利用传统的鉴别方法较难鉴别真伪，直接影响到用药安全。
目前，中药的鉴别主要依靠传统五大鉴别手段——基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定和生物鉴定。但是，随着中药产业的快速发展，鉴定工作量需求越来越大、传统鉴定人才不断缩减、传统鉴定方法费时费力，已经远远不能满足现阶段医院、企业、药店、海关等各行业的鉴定需求，因此亟需一种能快速又准确鉴定中药的新方法。

DNA条形码鉴定技术是一种新的生物鉴定方法，它能够在基因水平上提供一种鉴别依据，快速、准确地进行鉴定，本身又不受外界因素和本身性状影响，。本文利用DNA条形码技术对墨旱莲及其混伪品进行鉴定研究，能够准确、简便地鉴定墨旱莲药材和其易混伪品，对保障墨旱莲使用的安全和有效具有十分重要的意义^[4]。

1.3 研究内容及目标

1.3.1 研究内容

直接从药材中提取DNA的方法有试剂盒法、CTAB法、SDS法、高盐低PH值等各种方法，通过比较几种提取方法，得出了适合药材提取的方法，在这里我们使用的是试剂盒(Tiangen Biotech Co. ,China)法。墨旱莲及其混伪品DNA条形码ITS2序列的获得，通过改变PCR反应条件来提高ITS2序列扩增效率，对序列进行评价，构建DNA条形码鉴定体系。

1.3.2 目标

解决如何直接从药材中提取DNA的实际问题。提高ITS2序列扩增效率，建立墨旱莲及其混伪品的ITS2的鉴定体系，从分子水平鉴定不同基原的种间种内变异情况。

1.4 DNA条形码技术

1.4.1 DNA条形码技术的概念

DNA条形码技术是利用标准的、具有足够变异的、相对较短且易扩增的DNA片段在物种内的特异性和种间的多样性所创建的一种新的生物身份识别系统，从而实现对物种进行快速的自动鉴定^[5]。DNA条形码技术是通过筛选确定通用条形码，从而建立条形码数据库和鉴定平台，在比对分析DNA 数据时运用生物信息分析法，从而对物种进行鉴定^[6]。

1.4.2 DNA条形码技术的发展及优势

加拿大科学家Paul Hebert等人通过对动物界脊椎动物和无脊椎动门13320个物种分类研究发现，COI基因对动物鉴定具有良好的鉴别效果，并将其作为动物鉴定通用条形码序列，由此率先引入了DNA条形码技术的概念DNA分子鉴定概念的提出打破了传统鉴定学的框架，掀起了物种鉴定的巨大改革浪潮，Gregory认为，继人类基因组计划之后，DNA条码的创新研究将成为一个全球性的科学计划。如今DNA 条形码已成为全球生物分类学的研究热点方向^[7-8]。