摘 要

急性白血病（Acute Leukemia, AL) 是一类由于造血组织中的原始细胞异常增殖所引起的恶性疾病，临床可能表现为贫血、出血或继发性感染等。柔红霉素(Daunorubicin, DNR)作为一类蒽环类抗癌药物，在临床上对急性白血病有较好疗效，但柔红霉素较高的毒副作用和较低的溶解度限制了其在临床上的应用，降低了其抗癌作用。为了提高柔红霉素在溶液中的溶解度，增加对细胞的选择性来降低毒副作用，聚合物胶束、微球、脂质体或聚合物纳米粒子等载药系统的研究得到了广泛的关注。但是，传统方法工艺比较复杂，而且少有靶向作用，因此得到的进展并不十分令人满意。

本研究通过三步亲核加成反应合成了一种叶酸靶向的透明质酸（hyaluronic acid，HA）纳米粒，用于柔红霉素给药。（1）制备透明质酸-对羟基苯甲醛（HA-CHO）；(2)制备对羟基苯甲醛-透明质酸-叶酸（HA-FA）；(3)制备高分子前药透明质酸-柔红霉素（HA-imine-DNR）。

叶酸受体（folate receptor，FR）在肿瘤细胞表面高度表达，具有组织特异性，叶酸（folic acid，FA）作为FR的天然配体，对其有高度特异性和亲和力。此外，肿瘤细胞内环境的pH值（pH5.0）也与正常细胞中（pH7.4）的不同，由于叶酸的靶向作用，载有DNR的HA纳米粒能够较为准确的靶向定位到肿瘤细胞，由于前药中含有亚胺键，在弱酸性环境下可断键而释放药物，达到增强药效，降低毒性的目的。本研究在柔红霉素临床用药上有潜在的前景。

关键词：透明质酸；pH响应纳米粒子；药物控制释放；柔红霉素叶酸靶向

Abstract

Acute Leukemia (AL) is a malignant disease caused by abnormal proliferation of primitive cells in hematopoietic tissue. Daunorubicin (DNR), as a kind of anthracycline anticancer drugs, has a good clinical effect on acute leukemia, but the strong side effects and low solubility of Daunorubicin limit its clinical application and reduce its anticancer effect. In order to solve those problems, drug delivery systems such as polymer micelles, microspheres, liposomes or polymer nanoparticles have attracted extensive attention. However, traditional methods are more complex and have little targeting effect, so the progress is not very satisfactory.

In this study, a folate-targeted hyaluronic acid (HA) nanoparticle was synthesized by three steps of nucleophilic addition reaction for the administration of daunorubicin. Folate receptor (FR) is highly expressed on the surface of tumor cells and it has tissue specific. (1) preparation of HA-CHO;(2) preparation of HA-FA;(3) preparation of HA-imine-DNR. Folic acid (FA), as the natural ligand of FR, has highly specific and affinity to FR. In addition, the tumor cells outside environment of the pH value (pH lt; 6.5) is different from normal cells (pH7.4 slightly). Because of the targeting function of FA, carrying HA-imine-DNR nanoparticles can accurately target to tumor cells. Besides, due to the prodrug contains enamine bonds, which can be broken in weak acid environment, the nanoparticles can release drugs and enhance the efficacy of DNR. This study has potential prospect in clinical application of daunorubicin.

Keyword: Hyaluronan, pH-Responsive Nanoparticles, Controlled drug release, Daunorubicin, Folate-targeted

目录

中文摘要 1

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1当前癌症现状与癌症治疗 1

1.2纳米载药系统 1

1.2.1纳米载药系统的特点 2

1.2.2纳米药物的释药机制 2

1.2.2.1 pH响应释药机制 3

1.2.3纳米药物的靶向性 3

1.2.3.1 EPR效应 4

1.2.3.2叶酸靶向释药机制 4

1.2.4纳米载药系统分类 4

1.2.5纳米药物传递系统在化疗中的作用 4

1.2.6纳米粒子的评价方法 5

1.3高分子前药 5

1.3.1透明质酸（HA） 6

1.4抗癌药物柔红霉素 6

1.5本课题的研究内容 6

第二章 高分子前药HA-imine-DNR的制备及表征 8

2.1引言 8

2.2实验部分 8

2.2.1实验仪器与材料 8

2.2.2对羟基苯甲醛-透明质酸（HA-CHO）的合成： 9

2.2.3对羟基苯甲醛-透明质酸-叶酸（HA-FA）的合成： 9

2.2.4透明质酸-柔红霉素（HA-imine-DNR）的合成： 10

2.2.5紫外光谱表征 11

2.2.5红外光谱表征 12

2.2.6 ¹H-NMR表征 12

2.2.7高分子前药载药量的测定 12

2.3实验结果与讨论 13

2.3.1红外波谱解析 13

2.3.2核磁共振氢谱解析 14

2.3.3紫外光谱解析 15

2.3.4 HA分子量、投料比对载药量的影响 18

2.4本章小结 18

第三章 透明质酸-柔红霉素纳米粒的制备表征及体外释药 19

3.1引言 19

3.2实验部分 19

3.2.1实验仪器与材料 19

3.2.2实验步骤 20

3.2.2.1透明质酸-柔红霉素（HA-imine-DNR）纳米粒的制备 20

3.2.2.2纳米粒的形态表征 21

3.2.2.3纳米粒体外释药行为研究 21

3.3实验结果与讨论 22

3.3.1纳米粒的粒径分布及形态形貌观测 22

3.3.2 纳米粒稳定性研究 23

3.3.3释放介质的pH对纳米粒体外释药性能的影响 24

3.4本章小结 25

第四章 结论与展望 26

参考文献 27

致谢 29

第一章 绪论

1.1当前癌症现状与癌症治疗

当前社会，人类的主要死因是非传染性疾病。仅仅次于心血管疾病，癌症是大多数国家人群死亡的第二大原因。但是近年来，经济较发达国家由于心血管疾病死亡的人数逐年下降，最终，癌症可能会成为导致人类死亡的首要原因。癌症发病的病因学因素相当多，可能是由于吸烟，酗酒或不恰当的饮食习惯、生活习惯，也可能是因为偶然的细菌、病毒感染，或是由家族遗传诱发。在2018年，中国人口约占世界总人口的18.6%，但是当年的癌症发病率和却占世界癌症总发病率的23.7%，癌症死亡率占当年世界总癌症死亡率的30%左右^[1]。如何降低癌症患者的死亡率，延长患者的生命，改进临床的治疗方法，成为且将长期成为一个十分重要的研究话题。

然而，许多抗肿瘤药物具有非特异性细胞毒性，这会对机体正常组织和正常细胞产生较大的毒副作用，甚至可能会损害肝脏和骨髓，为了改进临床疗法，许多研究者将研究方向转向了纳米载药系统^[2-5]。纳米技术为癌症临床治疗的发展提供了新的解决方案，它能为临床治疗带来更高的安全性和疗效，但直到目前为止，纳米技术在临床上的应用仍然受到限制。由于纳米粒子独特的尺寸，使它具有不同于分子或更大粒子的特殊性能，例如传输特性、生物学特性、光学特性、磁性、电子和热特性等，这些特性可以应用在癌症的临床治疗上，这也使得纳米粒子具有了独特优势^[6]。与传统的化疗药物或生物大分子药物相比，纳米颗粒的大尺寸也使得除了活性药物成分外，还可以在其中加入多种支持性成分，这些成分具有促进纳米粒溶解、防止其降解、缓释、控释、组织穿透、靶向和触发激活的功能。同时，因为其尺寸特点，纳米颗粒具有独特的血液动力学特性和生物分布特性^[6]。在许多不同种类的纳米载药系统中，pH响应纳米载药系统由于其酸碱敏感性而备受关注，酸敏感的纳米载药系统可以控制药物释放，这在生物医学领域有潜在的应用价值。

1.2纳米载药系统

纳米粒子(NPs)通常是小于1000纳米的胶体颗粒，其制备方法通常是将药物包封在囊泡内，或将药物分子分散在基质中^[7]。NPs作为药物载体时，具有生物利用度高、系统稳定性好、载药量高、血液循环时间长、选择性分布于半衰期较长的器官或组织等显著的优势。NPs的选择性靶向可以通过增强通透性和保留效应(EPR-effect)，结合特定的配体，或者通过改变特定系统的生理条件，如自然、pH、温度等进行选择性分布来实现。其中，本研究使用的是pH响应和叶酸靶向的释药机制。

1.2.1纳米载药系统的特点

纳米药物可以使治疗方案的设计多元化，使其拥有更多有用的功能。换句话说，为了使得治疗方案更加丰富，可以将其他有效成分包封在纳米粒子中，这主要是由于纳米粒子独特的尺寸，小分子药物则不能达到这种效果。

（1）提高溶解性和缓释

纳米药物最简单的功能就是增强药物的溶解性。大多数的化疗药物水溶性非常差，这增加了它对机体的毒副作用。例如，因为水溶性差，在临床上，多西他赛和紫杉醇与吐温80和聚乙氧基蓖麻油(Kolliphor)一起使用，因此，癌症患者需要使用类固醇和抗组胺药物来减少这些溶剂对机体的副作用。而纳米药物可以作为一个更安全的选项来替代这些有害的溶剂，例如，白蛋白结合型紫杉醇（Abraxane），一种以白蛋白为基础的载有紫杉醇的纳米药物，被美国食品药品监督管理局批准用于治疗几种类型的癌症^[8]。白蛋白是血液中最丰富的蛋白质，是内源性疏水分子的载体，被应用于纳米药物领域。临床研究表明，Abraxane以比传统配方高50%的紫杉醇剂量给药，但是其毒副作用反而比传统配方给药更低，此外，由于其低致敏性，可以短时间更大剂量的注射^[9]。这种纳米药物所带来的安全性被认为是由于其改善了药物代谢动力学所导致的。 纳米载药系统的另一个显著优势是其较高的载药能力，这通常可以通过纳米粒自组装实现。这一优良性能可以减少过量不必要的药物剂量，从而降低其毒副作用。除了提高溶解度，纳米药物可以通过控制释放使血药浓度在治疗窗之内，而不是达到中毒浓度，这也是优于小分子药物的一点^[6]。

（2）防止降解

纳米载药系统可以显著减少药物在机体内的酶降解和机械降解。当某些药物半衰期较短，在机体内易被清除时，这一特性就显得尤其重要。例如，基因沉默剂为调节疾病相关的信号通路提供了新的方法，然而，血液、细胞外环境和溶酶体中所含的酶会使其迅速失活^[10]，因此，对这类药物而言，化学修饰和药物传递系统就十分重要。

（3）联合治疗

综合治疗方案被视为癌症治疗方案的标杆。事实上，同时靶向多个部位或多个药物同时作用于一个部位往往能够提高疗效。研究同时指出，调整联用药物之间的比例是一个较为关键的问题。纳米载药系统的特点在于，它可以将多种药物包封在同一个纳米粒中，与考虑单个药物的药代动力学相比，在纳米颗粒中共包埋更容易实现理想的瘤内和细胞内药物比例^[6]。

1.2.2纳米药物的释药机制

纳米药物除了以上的功能，还可以激活或释放抗肿瘤药物。在肿瘤微环境中有些特定的坏境或物质可以触发纳米粒的药物释放，如低pH值、高水平的谷胱甘肽和大量的酶。此外，纳米药物还可以对一些特定的外源性刺激做出反应，如热、超声和磁场，可以诱导纳米材料释放药物，应用于肿瘤的治疗。例如，一个正处于临床试验阶段的热敏型纳米药物ThermoDox，当温度大于39℃时，它就能释放阿霉素^[11]。

1.2.2.1 pH响应释药机制

纳米载药系统的表面功能化通常是使药物分子与载体以共价键方式结合，这样的载药系统更加稳定，但是在特殊的酸或碱环境下，如肿瘤细胞内或肿瘤组织周围处 ，pH值小于正常组织附近的pH值，因此，载药系统需要使共价键断裂，继而释放药物，以达到治疗目的。pH响应的载药系统主要是通过引入一些pH敏感的化学键，例如亚胺键、酯键、腙键等来达到pH响应的功能。pH响应的纳米载体部分响应机制如下：

（1）亚胺键引发

本研究中的载体表面氨基化修饰是由透明质酸(HA)的羧基与柔红霉素(DNR)的氨基反应结合形成亚胺键。 亚胺键在弱酸性环境下易水解，机体正常组织的pH值约为pH 7.4，肿瘤细胞的外环境约为pH lt;6.5，内泌体约为pH 5.0-6.0，溶酶体约为pH 4.0-5.0^[12]，在正常组织附近亚胺键极少水解，而在肿瘤细胞周围或肿瘤细胞内，亚胺键水解释放药物。

（2）酯键引发

药物分子若能直接与载体形成酯键，则可以酯键引发释药。酯键在正常组织中较稳定，但在酸性环境下可断裂进而释放药物^[13]，其水解速率可通过pH值调控。

1.2.3纳米药物的靶向性

纳米药物的靶向性主要是以配体和受体的偶联为基础的，当纳米药物载有或本身含有配体时，其在体内就能特异性识别对应的生物受体，这使得纳米药物可以靶向性的治疗特定疾病。纳米药物通常会被设计成能够识别肿瘤细胞上高度表达受体的纳米粒，而此受体在正常细胞表面通常不表达或很少表达，这就使得纳米药物在进入体内后能够靶向性的与肿瘤细胞结合，由于受体介导的胞吞作用，纳米药物就可以进入肿瘤细胞内并释放药物。但是在药物载体上接上靶向分子，可能会增大纳米粒的尺寸，控制纳米粒的适宜尺寸成为一个比较关键的问题。靶向性的纳米药物目前虽还未上市，但已经有几种药物正在进行临床试验。

1.2.3.1 EPR效应

实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect)，简写为EPR效应，在1986年首次被提出，指的是一些特定尺寸的粒子趋向于聚集在肿瘤组织周围的倾向，而在正常组织周围则没有这种情况^[6]。EPR效应的存在，使得纳米药物具有被动靶向性，利于药物滞留在肿瘤组织附近，降低了药物对正常组织的毒副作用。基于EPR效应所设计的纳米药物所具有的特点，为其带来了广阔的应用前景。但是这也对纳米药物的尺寸有了较为严格的要求，尺寸过大（＞500nm）不易透过肿瘤组织的血管，也不易进入到肿瘤细胞内；尺寸过小（＜10nm）则在体内极易被清除，治疗效果较差^[14-15]。肿瘤组织的血管结构较为混乱，导致肿瘤部位的血流异常。利用EPR效应改善抗肿瘤药物的靶向性其实是利用了肿瘤特殊的血流动力学特性。

1.2.3.2叶酸靶向释药机制

叶酸（FA）是维持机体正常生理功能的必需物质，研究发现，许多肿瘤细胞膜表面，叶酸受体（FR）高度表达，可识别并结合叶酸，而正常细胞中的叶酸受体很少表达。根据这种差异，可以将药物载体与叶酸偶联，制备成具有肿瘤靶向功能的抗癌药物。与药物载体结合的叶酸，其对叶酸受体仍有高亲和力，能被叶酸受体识别^[16-17]，并与药物载体一起通过叶酸受体介导的胞吞作用进入肿瘤细胞^[18]。叶酸受体介导的载药系统，制备较为简单，易合成，且靶向效果较好。

1.2.4纳米载药系统分类

根据制备方法的不同，纳米药物载体可分为固体脂质纳米粒(SLN)、纳米胶囊、脂质体、纳米球、聚合体和胶束。固体脂质纳米粒（SLN）是通过在脂质中掺入药物制备而成的，药物被嵌入或包裹到整个类脂核之中。纳米凝胶囊是一个囊状系统，常用于封装亲脂类药物，药物被一个单一的聚合物膜包围在内。如果这个聚合物膜是多层的，那么就叫做聚合体。脂质体则是由磷脂构成的微囊。这些纳米载药系统通常由可降解的高分子材料制成，以避免其在机体内造成蓄积中毒。

1.2.5纳米药物传递系统在化疗中的作用

一般来说，纳米粒子（NPs）是高分子聚合物或脂质微小颗粒，药物可以溶解、包裹、包埋在这些高分子聚合物或脂质小颗粒中、嵌入其中或吸附在其表面。纳米粒子可改变抗癌药物在机体内的分布和药代动力学特性，从而减少因为非特异性的抗癌药物输送至正常组织中所产生的副作用。纳米药物输送系统（NPDDS）可极大地延长药物在组织和血液中的半衰期()，从而减少用药剂量，降低患者的依赖性并提高其生活质量。例如，天冬酰胺酶用于治疗淋巴细胞白血病的半衰期很短(半衰期在8到30小时之间)，需要每天服用4周，但是用聚乙二醇制成纳米药物传递系统后，仅需每两周注射一次。许多研究已经制备出了如纳米胶囊、脂质体、纳米球、聚合体和胶束之类的纳米药物传递系统，并且对他们的性能进行了评价。癌症化疗始于20世纪40年代初，而当前临床所使用的药物和剂型仍在不断改进中，许多新药正处于不同的临床试验阶段。目前，许多学者正在努力通过改进药物剂型来提高癌症的治疗效果。NPDDS由于其具有的靶向癌细胞的潜力，受到了学者们的广泛关注。NPDDS可以克服传统癌症化疗的缺点，可以做到在不产生耐药性的情况下，有选择地、连续地、可控制地为癌细胞供应药物，由于NPDDS可以选择性给药，临床上的给药剂量就可以降低，能有效降低抗癌药物的毒副作用。因此，纳米药物传递系统在化学治疗中有潜在的前景。

1.2.6纳米粒子的评价方法

纳米粒子有以下一些常见的表征方式：

粒径：粒径是评判纳米粒子体内活性的重要参数。已有文献证明，单核巨噬细胞吞噬系统(MPS)对药物的识别和吞噬功能与纳米粒子的大小密切相关。相比于较大粒径的颗粒，粒径小于200nm的纳米粒子在体内的停留时间更长，清除率更低，从而可以延长药物的半衰期。纳米粒子的理想粒径是70-200nm，纳米粒过小（＜30nm）会经由肾脏排泄出体外，粒径过大（＞200nm）则会由调理作用分布到肝、肾、肺、脾等部位。

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