摘 要

本试验通过基因工程的手段，构建出了含有酸性磷酸酯酶的工程菌，该菌种能够高效的产生酸性磷酸酯酶。通过从大肠杆菌中抽取酸性磷酸酯酶基因，利用PCR技术扩增基因组，并纯化，然后将纯化后的基因转化到菌株的表达载体pMA5上，最后把它导入到菌株WB800内。实验主要结果如下：

（1）通过PCR扩增酸性磷酸酯酶基因后,用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在约700bp左右有明显条带，与推测的目的基因的大小相一致。

（2）将重组质粒转化进枯草芽孢杆菌WB800中，与未经重组的WB800菌体破碎上清相比，WB800-pMA5/AcpPD菌体破碎上清酶液在30KDa左右有明显条带，与推测的目的蛋白的分子量大小相一致。说明该酸性磷酸酯酶在枯草芽孢杆菌WB800中得到了正确表达。

（3）表达蛋白的分子量在29kD左右，与预测的相一致。利用Ni-NTA吸附柱，成功纯化出重组酸性磷酸酯酶。

关键词：酸性磷酸酯酶 PCR 基因克隆 重组表达 酶活性

Gene cloning, recombinant expression of an acid phosphatase

ABSTACT

By the means of the genetic engineering, to build an acid phosphate esterase-containing engineering bacteria, the bacteria can efficiently produce acidic phosphatase. In the process of the construction of the recombinant strain, the enzyme gene was extracted from Escherichia coli and the gene was cloned into Bacillus subtilis expression vector pMA5, and then introduced into Bacillus subtilis WB800 to express it efficiently. The main results of this experiment are the following :

First, by amplifying the acid phosphatase gene, the PCR product was detected by agarose gel electrophoresis and had a significant band at about 700 bp, which was consistent with the size of the predicted target gene.

Second, transforming the recombinant plasmid into bacillus subtilis WB800, and the WB800-pMA5 / AcpPD cell disintegration supernatant had a significant band at about 30 kDa compared with the untreated WB800 cell crushed supernatant. The molecular size of the target protein is consistent. Indicating that the acid phosphatase was correctly expressed in Bacillus subtilis WB800.

Thirdly, the molecular weight of the expressed protein is about 29 kDa, which is consistent with the predicted. Recombinant acid phosphatase was successfully purified using Ni-NTA adsorption column.

Key words: Acid Phosphatase；PCR；Gene Clone；Recombinant expression；Enzymatic Activity

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 酸性磷酸酯酶概述 1

1.1.1影响酸性磷酸酯酶活性的因素 1

1.1.1.1金属离子 1

1.1.1.2温度 2

1.1.1.3 pH值 2

1.2酸性磷酸酯酶的应用 2

1.2.1在临床酶学诊断上的应用 2

1.2.2在精斑鉴定中的应用 3

1.2.3酸性磷酸酶在肿瘤治疗方面的应用 3

1.3实验研究内容及研究现状 3

1.3.1实验研究目的 3

1.3.2实验研究现状 4

第二章 利用枯草芽孢杆菌构建酸性磷酸酯酶工程菌 5

2.1实验器材 5

2.1.1实验材料 5

2.1.2 实验试剂 6

2.1.3 工具酶和试剂盒 6

2.1.4 实验所用菌株、质粒和培养基 6

2.2 试验方法 7

2.2.1 酸性磷酸酯酶基因序列引物设计 7

2.2.2 酸性磷酸酯酶基因的PCR扩增和纯化 8

2.2.3 目的基因与穿梭载体pMA5连接和重组质粒的转化 9

2.2.4 菌落PCR鉴定阳性重组子DH5a-pMA5/AcpPD 10

2.2.5 重组载体的双酶切鉴定 10

2.2.6 酸性磷酸酯酶基因测序及其分析 11

2.2.7 构建重组枯草芽孢杆菌WB800-pMA5/AcpPD 11

2.2.8 重组枯草芽孢杆菌WB800-pMA5/AcpPD的发酵表达 11

2.2.9 酸性磷酸酯酶活性测定方法 12

2.2.10 SDS-PAGE检测目的蛋白 12

第三章 结果与讨论 13

3.1 目的基因的扩增和纯化 13

3.2 质粒WB800的提取 13

3.3 菌落PCR鉴定阳性重组子DH5a-pMA5/AcpPD 14

3.4 构建重组枯草芽孢杆菌WB800-pMA5/AcpPD 14

3.5 重组酶的纯化 15

第四章 结论和展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献 18

致谢 20

第一章 文献综述

1.1酸性磷酸酯酶概述

酸性磷酸酯酶是普遍存在的酶，简称ACP。在酸性环境中，ACP可以水解各种各样的酯和酸酐磷酸，并且释放出磷酸盐。该酶在能量代谢，信号传导中起着重要的作用，给植物提供营养元素P。ACP大部分存在于动植物中，细菌及其它微生物也能够少量产酶。该酶的生物活性最早是从米糠中发现的（刘继强，柯雪琴等，2007）；此后，Kostrewa等（1999）报道了酸性磷酸酯酶的分子结构^[2]；Gargova等（2003）报道了黑曲霉液体发酵产酸性磷酸酯酶的研究，发酵9天产酶量达到高峰^[3]。

酸性磷酸酶广泛存在于生物界，从低等生物大肠杆菌，酵母到高等动植物组织，体液以及人类肝脏、前列腺等都发现有酸性磷酸酯酶的存在（Saini MH, Van Etten,1979；TO-EA, UEDA Y等，1973）^[6]。ACP和物质的新陈代谢相互联系，磷酸可作为一类催化剂，催化有机含P化合物，使有机化合物发生溶解，在细胞代谢中发挥重要功能。