1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

纸质文物纸张的成分是纤维素，自然状态下，纤维素稳定存在，但易被纤维素酶彻底水解为葡萄糖，因此，侵染纸质文物的微生物酶主要是纤维素酶。

1.纤维素

#160;#160;纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，是植物细胞壁的主要成分。常温下，纤维素既不溶于水，又不溶于一般的有机溶剂，如酒精、乙醚、丙酮、苯等。它也不溶于稀碱溶液中。因此，在常温下，它是比较稳定的，这是因为纤维素分子之间存在氢键。纤维素不溶于水和乙醇、乙醚等有机溶剂，能溶于铜氨Cu(NH3）4（OH）2溶液和铜乙二胺[NH2CH2CH2NH2]Cu（OH）2溶液等。

2.纤维素酶

#160;#160;纤维素酶是将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单种酶，主要由三个组分组成：#129;内切葡聚糖酶，即C1酶；#8218;纤维二糖水解酶，即Cx酶；#402;β-葡萄糖苷酶。他们在适当条件下协同作用，将纤维素水解为葡萄糖。

3.纤维素酶水解纤维素时酶活性的确定

#160;#160;纤维质底物的不均一性、不同微生物产生纤维素酶的复杂性、纤维素酶作用于纤维素时彼此之间的协同作用等各种因素导致目前纤维素酶水解纤维素的分子机制以及结构尚待进一步阐释，因此不同实验室有关酶活的测定差异较大。虽然1984年IUPAC生物技术委员会曾经公布过纤维素酶测定的标准方法且其中一些方法为生物技术专家广泛接受，但酶学专家则认为这些方法太过局限。直到Wood和Bhat重新分析了实验室里用来测定真菌纤维素酶的方法，并指出了各种方法的利弊。虽然其中大部分方法是针对木酶纤维素酶的，但同时也可用于其他微生物产生的纤维素酶。

#160;#160;该方法强调用不同底物来测定不同纤维素酶组分，具体方法为：用微晶纤维素和无定形纤维素来测定外切-1,4-β-葡聚糖酶（C1酶）的酶活；用羧甲基纤维素（CMC)和无定形纤维素测定内切-1,4-β-葡聚糖酶（Cx酶）的酶活；用纤维二糖，水杨苷（salicia）测定β-葡萄糖苷酶(CB酶）的酶活；用滤纸和棉花测定总酶活(C1 Cx CB)

#160;#160;由以上可知，用羧甲基纤维素钠和滤纸作底物时，可测出内切-1,4-β-葡聚糖的酶活（CMC酶活)和纤维素总酶活（FPA酶活）的大小；CMC酶活大小为定值时，FPA酶活大小即可反映出另外两种酶活性的大小

4.酶活测定方法

一、#160;#160;#160;主要试剂

DNS（3，5-二硝基水杨酸）显色液的配置：称取酒石酸钾钠182g溶于500mL的蒸馏水中，加热至50℃溶解，于溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠20g，加热搅拌，使之溶解，再加入苯酚5g，无水亚硫酸钠5g，搅拌使之溶解，冷却后定容至1L，储存于棕色试剂瓶中，放置一周后使用。

柠檬酸缓冲液（0.05mol/L，pH4.8）：称取一水柠檬酸4.83g，溶于约750mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g，定容至1L，调节溶液的pH到（4.8#177;0.5）备用。

CMC-Na溶液（1%）：称取1.000g羧甲基纤维素钠，加入pH4.8的柠檬酸缓冲液，水浴加热使之溶解，冷却后定容至100mL。

1mg/mL的标准葡萄糖溶液：准确称取经80℃干燥2h至恒重（两次测量值相差少于0.002g）的葡萄糖0.1g，用蒸馏水溶解并定容至100mL。

二、粗酶液的制备

液体发酵培养基：CMC-Na 5g，蛋白胨 3g，（NH₄）₂SO₄#160;2g，KH₂PO₄#160;4g，CaCl₂#160;0.3g，MgSO₄﹒7H₂O 0.3g，吐温-80 0.2g，121℃，灭菌20min。

细菌：活化细菌后，取1mL菌液接种至液体发酵培养基中（100mL），160rpm，37℃，2d。细菌粗酶液的制备：取1 mL菌液，4000rpm，4℃离心10min。取0.5mL上清液，即为粗酶液。

霉菌：霉菌接种至平板活化4d后，移一环至液体发酵培养基中（100mL），200rpm，28℃，5d。

霉菌粗酶液的制备：同细菌。

三、实验步骤

3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，以对应的吸光度OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，具体操作见表1。

表1 葡萄糖标准曲线的绘制

#160;#160;#160;#160;摇匀后置于沸水浴中加热5min后，自来水冷却至室温，蒸馏水定容至25mL，振荡混匀，540nm处测定OD值（每管取三个平行样）。

3.2 纤维素酶活测定方法

（1）于试管中加入CMC-Na溶液1.5mL。

（2）准确加入待测酶液0.5mL于三支样品管中（空白管不加），混匀。

（3）将四支试管同时置于50℃水浴中，反应30min，取出。迅速、准确的向各管中加入DNS试剂3.0mL。再于空白管中准确加入待测酶液0.5mL，摇匀。

（4）将四支管放入沸水浴，反应10min，迅速冷却至室温，定容至25mL。

（5）在540nm下，以空白为对照，测定三支平行管样液的吸光度，取平均值。

（6）以吸光度平均值查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。计算CMCA-DNS酶活力按下式计算：

CMCA=A#215;（1/0.5）#215;n#215;2

式中：CMCA#8212;#8212;羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力，μ/g或（μ/mL）；

#160;#160;#160;#160;#160;#160;A#8212;#8212;吸光度在标准曲线上查得的还原糖量，mg；

#160;#160;#160;#160;#160;#160;1/0.5#8212;#8212;换算成酶液1mL；

#160;#160;#160;#160;#160;#160;n#8212;#8212;酶样的稀释倍数；

#160;#160;#160;#160;#160;#160;2#8212;#8212;时间换算系数。

（对照液用同一酶液加入1mL10%NaOH使酶灭活，然后在加入底物，其余操作同上）

（另取一份稀释后的粗酶液0.5mL沸水浴10min灭活作为对照组）

（空白用蒸馏水代替酶液）

#160;

参#160;考#160;文#160;献

[1]#160;#160;方诩，秦玉琪，李雪芝，王禄山，汪天虹，朱明田，曲音.纤维素酶与木质纤维素生物降解转化的研究进展

[2]#160;#160;王兰芬.纤维素酶的作用机理及开发应用

[3]#160;王巧兰，郭刚，林范学.纤维素酶研究综述

[4]#160;王俊丽，聂国兴，李素贞，谢艳敏，曹香林.DNA法测定还原糖含量时最适波长的确定

[5]#160;史锋，王璋.混合非淀粉多糖水解酶酶活测定方法的改进

[6]#160;刘强，冯学琴.非淀粉多糖酶制剂的研究与应用进展

[7]#160;Hideki Baba Devebpment of bioconversion of cellubsic wastes(J).Micmb Technol.1993.(11):18~26

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[11]#160;庄新姝，王树荣，骆仲泱，安宏，岑司法.纤维素低浓度水解实验及产物分析研究

[12]#160;张毅民，杨静，吕学斌，马沛生.木质纤维素类生物质酸水解研究进展

[13]#160;Bhatia R B B rinker CJ.Aqueous sol-gel process for protein encapsulation(J).Chem Mater,2000,(12):2434~2441

[14]#160;佟明友，唐似茵，唐开宇，尹佩林.一种酶法水解纤维素物质的方法

[15]#160;高培基.纤维素酶降解机制及纤维素酶分子结构与功能研究进展

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

2.1本课题研究目的

文明的传承依靠文物，文化的传承大多依靠纸质文物，因此，纸质文物的历史价值，学术价值等非常珍贵，但由于纸质文物纸张的成分主要是纤维素，自然状态下极易受到纤维素酶的水解而遭到破坏，影响对其所携带的价值进行保护和研究。

#160;#160;纤维质底物的不均一性、不同微生物产生纤维素酶的复杂性、纤维素酶作用于纤维素时彼此之间的协同作用等各种因素导致目前纤维素酶水解纤维素的分子机制以及结构尚待进一步阐释，因此对于纤维素酶的研究文献资料暂时不是很多。本课题探讨在各种不同影响因素下纤维素酶活性的大小，从而将其活性保持在最低以减缓或停止其降解纤维素的速度，从而达到保护纸质文物的目的。