1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

理性改造大肠杆菌苹果酸酶提高l-苹果酸产量的研究

文献综述

摘要： l-苹果酸作为c4平台化合物是一种重要的天然有机酸，是生物细胞中tca循环中的重要化合物，被广泛应用于食品、医药及化工等领域，市场巨大。近年来微生物发酵法生产l-苹果酸的优势逐渐显现。随着l-苹果酸生物合成途径的阐明和大肠杆菌代谢途径的研究，运用基因工程、代谢工程手段发酵合成l-苹果酸已成为可能。本文阐述了l-苹果酸的应用，前景，合成方法和l-苹果酸生物合成代谢途径的最新研究。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

本课题以引入了外源磷酸烯醇式丙酮酸激酶pck的l-苹果酸生产菌株ba060（e.coli k12 #8710;pflb, #8710;ldha, #8710;fumb, #8710;frdabc, #8710;ptsg, #8710;ppc）为出发菌株，针对该菌株在发酵过程中存在副产物丙酮酸积累与nadh/nad 的比例过高影响糖转运效率的现象，根据大肠杆菌的厌氧代谢途径和苹果酸酶主要催化生成丙酮酸的生物特性，通过red重组系统结合xer/dif重组系统敲除苹果酸酶基因sfca, maeb，减少丙酮酸的累积，使碳代谢流截留在l-苹果酸，提高菌株代谢合成l-苹果酸的收率。本课题将获得目的菌株目的菌株ba071（ba060, #8710;sfca）、菌株ba072（ba060,#8710;maeb）和菌株ba073（ba060,#8710;sfca,#8710;maeb）、菌株ba071-pck（ba071/ptrc99a-pck）、菌株ba072-pck（ba072/ptrc99a-pck）和菌株ba073-pck（ba073/ptrc99a-pck） 。

拟解决的关键问题：

1、分别构建大肠杆菌基因敲除表达框sfca::gm, maeb::gm;

2、在以引入了外源磷酸烯醇式丙酮酸激酶pck的l-苹果酸生产菌株ba060的基础上利用red同源重组技术结合xer /dif 重组系统敲除分别敲除sfca及maeb，最终获得目的菌株菌株ba071（ba060, #8710;sfca）、菌株ba072（ba060,#8710;maeb）和菌株ba073（ba060,#8710;sfca,#8710;maeb）。