生物膜（biofilm），也称为生物被膜，是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。细菌不可逆的附着于惰性或活性实体的表面，繁殖、分化，并分泌一些多糖基质，将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物。生物膜是环境中微生物最普遍的一种存在形式，最早是在1674年由Antonie van Leuwenhoek利用显微镜在人类的牙齿表面所发现。

与游离态细胞相比，细菌形成生物膜结构来进行生活具有得天独厚的优势，生物膜具有稳定的三维结构，这是因为生物膜不是由细胞简单的通过聚集而形成的，生物膜含有大量的胞外物质，称为生物膜基质。生物膜基质可以为包裹在生物膜内的细胞提供养分、抵御外界不良环境，也可作为细胞的外部消化系统，增强细胞的代谢能力。生物膜基质包括细菌自身分泌的胞外聚合物（EPS）、汲取的营养物质、代谢产物以及细胞裂解产物和从周边环境中得到的物质，对于大多数细菌来说，生物膜的形成可使自身在环境中占据有利生态位，从而有利于自身的生存发展。作为细菌群生长的环境，生物膜的存在，不仅作为屏障为细胞的生命活动创造了稳定的内环境，介导了细胞与细胞、细胞与基质之间的连接，而且还承担了物质转运、信息的跨膜传递和能量转换等功能，这些都是由生物膜的本身的结构决定的。

一个完整的细菌生物膜发育周期可分为5个阶段。第一个阶段为可逆附着期，即浮游的单个细菌附着在载体表面的初始阶段，此阶段附着在载体表面的细菌也可以脱离载体回归到单个的浮游状态；第二个阶段为不可逆附着期，即细菌在胞外聚合物的作用下附着在载体表面，并且正常情况下不会回归到单个浮游态；第三个阶段为细菌生物膜形成初期，即附着在载体表面的细菌相互之间聚居生长并不断繁殖；第四个阶段为生物膜成熟期，即聚居成群的细菌继续生长和繁殖，最终形成具有三维结构的细菌群落，群落会根据它们所处的外界环境而选择最有利于生长的形状，例如扁平状、流线形，其中最典型的结构为“蘑菇”状；最后一个阶段为细菌散播再聚合期，即在细菌生物膜发育的后期，由于载体空间体积和营养物质的限制，生物膜会在中间形成一个空洞，通过该空洞释放出一些细菌和排泄物，被释放的细菌则会重新聚居起来并重新黏附新的载体而形成新的生物膜。

随着医学界对某些环境中常见细菌所致的一些慢性和顽固性疾病的深入了解，发现生物被膜是导致这些细菌性疾病难以根治的主要原因。以生物被膜形式存在的细菌不同于浮游细菌，它们对抗生素等杀菌剂、恶劣环境及宿主免疫防御机制有很强的抗性，生物被膜内的细菌在生理、代谢、对底物的降解或利用和对环境的抵抗能力等方面都具有独特的性质。故细菌生物膜不仅对人类的生活和环境构成重大威胁，而且在临床的疾病治疗中也是一项难点。如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌会对人类造成致命的疾病，并且对大多数抗菌药物产生耐药性。同样，在一些感染中，铜绿假单胞菌生物膜是细菌发病机制中的重要问题，监测和有效控制由这些病原体形成的生物膜对许多行业来说仍然是一项具有挑战性的任务。

本课题拟对金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌生物膜形成过程进行研究。在合适的培养基以及温度条件下，使用置片法对这两种细菌进行培养，使其依附于载体表面形成生物膜，使用银染法和SEM定性观察其生长状况，通过连续稀释的活菌计数法绘制生物膜的生长曲线，结晶紫染色后用乙酸进行脱色，测量洗脱结晶紫后脱色液的OD值来直接确定菌膜的形成量。通过在细菌生长的不同阶段对菌膜的生物量进行检测，进一步了解这两种易致病菌的生物膜，为监测这两种细菌的生物膜提供基础。

生物膜与人类的健康息息相关，人或动物的疾病感染与反复发作、医疗设施、食品或水源的污染、金属表面的腐蚀等，绝大多数都与细菌生物膜的存在有关。近年来，对于细菌的生物膜的研究依然属于热门话题，但不管是抑制生物膜的产生还是生物膜的酶解，甚至是生物膜的检测都没有完全搞清楚。本课题作为此研究的基础部分，对金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌的生物膜形成和鉴定进行检测，为防治细菌的生物膜以及生物膜的利用方面提供基础。

2. 研究的基本内容与方案

2.1基本内容：

毕业设计的主要目标是通过对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌在合适的载体上进行培养，形成生物膜，在生物膜的形成过程中进行定性的染色观察以及显微观察以观察不同时期生物膜的生长情况，同时对生物膜进行定量检测进一步确定生物膜的形成情况。首先对实验菌种进行复苏和保藏，并制备标准菌悬液后，将菌液置于24孔细胞培养板中孵育，每孔垂直插入无菌10mm×10mm盖玻片载体1片作为生物膜共培养的附着物，结晶紫染色观察生物膜在载体片上的粘附情况,银染法定性观察生物膜的生长情况，随后采用乙醇溶解结晶紫后酶标仪检测孔板内各孔在A595处的OD值来确定生物膜的生成量，据此可以做出生物膜随时间变化的生长曲线,同时采用活菌计数法定量检测一段时期内生物膜中活菌数的变化情况。

2.2技术方案：

1）取实验室保藏菌种，选择合适的培养基，平板选择培养单菌落，使菌种复苏，配制标准菌悬液。