样品DNA获取是现代生命科学研究与应用中必要和非常常见的基本技术要求，也是临床疾病检测、遗传配型等等应用的要求，因此高效分离、获取高产量、高纯度、高完整度DNA的方法不断得到改进。在已有的方法中，有些方法步骤繁琐，耗时长，对于临床快速检测以及其他应用及研究很不利，已经发展起来的磁珠分离DNA方法是比较理想的方法，但目前我国磁珠产品与国外产品相比缺乏竞争力，本项目希望为开发一种新的分离DNA用磁珠产品做些前期研究。

DNA分离的主要步骤为：破碎细胞、去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子、去除盐类有机溶剂等杂质、DNA的检测、贮存。传统的用于DNA分离的方法主要有以下三种:

1.CTAB裂解法：该方法是1980年Murray 和 Thompson发明的方法^【1】，使用溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）法可快速分离高纯度的大分子量植物DNA。经液氮研磨样品后，用适当体积CTAB缓冲溶液重溶样品，CTAB是一种阳离子型去垢剂，它能使核酸和酸性的多糖从低离子强度的溶液中沉淀出来^【2】，同时，蛋白质和中性多糖等杂质留在溶液中，从而得到粗分的DNA。

2.酚抽提法（该分离方法是由Blin等^【3】根据 Gross-Bellard等提出的原始方案改良并建立的）：酚处理目标样品匀浆液，由于蛋白质与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团，与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于有机相酚中，而DNA溶于水相。离心分层后取出水相，再利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀出核酸DNA^【4】。

3.盐析法：利用饱和的氯化钠使蛋白质沉淀，再使用乙醇沉淀上清中的DNA，从而分离得到DNA^【5】

上述方法虽然具有实验试剂常见，实验成本低的优点，但存在所需生物样本量较大，操作繁琐,耗时长,使用的有机溶剂对人体伤害大，分离效率低,重复性差，难以实现自动化操作的缺点，因此，伴随着分子生物学及高分子材料学的发展，从液相系统中分离核酸的传统技术逐渐被以固相载体为基础的新方法所取代。

以固相吸附物载体为基础的新型核酸提取方法主要有：旋转离心柱提取法、玻璃珠吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法和纳米磁珠提取法。这类方法的操作主要分为三个阶段：（1）利用碱裂解液促使细胞破裂，使核酸释放于液相（2）利用载体对核酸的较强亲和力和吸附力，将释放出来的核酸特异性地结合在特定的载体上，使蛋白质、多糖和脂类等其他杂质依然游离于液相中，随上清的移走而被除去（3）通过调节洗脱液的离子强度和pH值，将吸附于载体上的核酸洗脱下来而得到纯化后的核酸。

其中离心柱法DNA提取试剂盒以低廉的价格和相对便捷的操作，应用的较为广泛，但随着DNA提取需求量的增多，其样本需求量大，损失多，无法用于珍稀样本DNA的提取，需要反复离心，不便于高通量自动化操作的缺点逐渐暴露。为了适应现代分子生物学高通量，高灵敏度，自动化操作的发展需求，20世纪90年代，磁珠法DNA提取技术诞生，并自此得到广泛关注^[6-11]。磁珠法分离DNA的优点有：（1）操作简单快速：不需要昂贵的液相色谱系统，过滤器或其它设备，不需要离心，避免了连续重复的手工抽提。（2）样品需求量低：微量的材料即可得到高浓度的核酸。（3）质量稳定可靠：游离的磁珠与核酸的结合量更大，特异的结合使得核酸纯度更高，且可通过控制磁珠表面基团来调节磁珠回收量。（4）全自动化操作（5）安全无毒无害：试剂不含酚、氯仿等有毒化学试剂，符合环保的理念。使用磁珠法分离DNA的原理为：DNA与磁珠表面的特异性功能基团相互作用，从而可逆性地结合于磁珠表面，而蛋白质等杂质不与磁珠结合，利用磁珠自身具备的磁响应能力，在外加磁场的作用下将结合有DNA的磁珠与其他物质相分离，再通过洗脱的方法将DNA释放出来从而得到DNA^[12]。

目前用于分离DNA的磁性微珠多种多样，就其表面修饰的基团的不同，可主要分为以下几类：羧基磁性微珠（1994年Hawkins使用羧基磁性微珠成功提纯质粒DNA）^[13]分离原理：研究认为使用较高浓度的PEG和NaCl导致DNA分子水化层脱去，胶体学稳定性破坏，构象随之改变，带负电荷的磷酸基团大量暴露在外面；带负电荷的磷酸基团通过钠离子与羧基形成“电桥”，使得DNA被特异吸附到羧基高分子表面，而其他杂质不被吸附，再通过除去高浓度PEG和高盐使得DNA的构像及理化性质得以恢复，从而将DNA洗脱下来，实现分离^[14]。氨基磁性微珠（Brandon Yoza在2002年首次提出用氨基修饰的磁珠分离DNA的方法）^[15]，该方法的原理为：在一定酸度条件下，氨基磁球表面带正电荷，DNA磷酸基带负电荷，DNA 通过静电相互作用与磁珠特异性结合而不与蛋白质等杂质结合，再通过改变酸度使DNA得以释放，实现分离。SiO₂磁性微珠（硅磁珠）^[16]分离原理与羧基磁性微珠相似，SiO₂经活化后可在表面产生大量的羟基，溶液中带正电的Na 或Mg² 等离子在带负电荷的DNA和表面羟基之间充当了“电桥”的角色，使DNA在其表面特异性吸附而得以分离^[17]，除以上三种之外还有多聚乙烯亚胺（PEI）改性磁性微珠^[18]等。以上磁珠方法分离得到的DNA符合要求，但磁珠制备方法中多采用复杂有机物对磁珠进行修饰，如聚乙二醇，APTES，TEOS等。

常用的磁珠法核酸分离试剂盒，目前主要为国外产品，例如Promega, Roche, KingFisher（赛默飞）, Dynal，Qiagen等，国内将磁珠应用于核酸分离的研究，起源于2002年左右，起步较晚，国内的产品主要有：海狸纳米、洛阳惠尔纳米、上海奥润微纳、长春博坤生物、上海百运纳米等。

本实验室已经研制出一种新型磁性微珠，前期研究表明，该磁珠有良好的磁响应性、对DNA有良好的吸附能力，也找到了洗脱DNA的方法，能得到较高的DNA回收率，但前期研究未完成对实际样品中DNA的提取与分离，本论文即开展应用自行研制的磁珠从实际样品中分离获取DNA的研究。