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CRISPR/Cas9系统介导的转录因子KLF4基因敲除雌性生殖干细胞系的构建研究开题报告

 2020-04-13 15:04:14  

1. 研究目的与意义(文献综述)

动物体所有的组织和器官都是由存在于早期胚胎干细胞库中的干细胞分化而来的。在机体的生长与发育过程中,衰老、受损或丢失的组织和器官中也要通过干细胞再生和分化来修复。传统观点认为,女性和绝大多数雌性哺乳动物卵母细胞的产生仅发生在胎儿期,出生后卵母细胞数目不再增加。2009年上交通大学的吴际教授及其研究团队实现了分离得到长期自我更新的雌性生殖干细胞(fgscs),并移植到不孕小鼠卵巢内成功培育出了下一代。这一结果的发现为卵子的产生及干细胞的自我更新做出了贡献。此外,该研究组分离纯化的细胞在未分化的状态下表达干细胞多能性及生殖细胞的标志物,例如碱性磷酸酶(akp), oct4, sox2 and ssea-1,在对cd-1小鼠雌性生殖干细胞的体外检测中发现,该细胞能表达mvh,dazl,oct-4,stella,blimp1,fragilis等生殖细胞的标志物,并且在传代40代左右进行免疫荧光检测仍是mvh阳性,证明了进行有丝分裂的雌性生殖干细胞的存在。此后,提取分离纯化雌性干细胞实验技术已经在国内外多个实验室得以实现,2012年2月white等成功地从20-30岁年轻女性的卵巢上皮组织中分离出卵母干细胞(oogoninial stem cells,oscs)。但是,对于雌性生殖干细胞的自我更新和单能性维持等分子机制的研究方面,国内外对此进行的相关研究较少。在基因组层面,2016年上海交通大学赵小东课题组通过全基因组表观遗传学数据分析解释了小鼠雌性生殖干细胞单能性维持的特定表观遗传学特征,揭示了dna甲基化对fgscs的单能性调节主要通过抑制体细胞程序并且潜在作用于fgscs的性别身份的维持。然而,目前对于fgscs身份决定的调控机制仍需要更多深入的研究,以加深对机制的理解及为其在临床上的应用奠定理论基础,与fgscs相关研究工作一起发挥改变不孕症治疗未来的潜力。

转录因子(tfs)在细胞命运决定的过程中起着重要作用,在基因组中约10%的基因编码转录因子,是理解发育的关键。tfs在干细胞中对于细胞的自我更新和多能性状态的维持、分化的方向性都发挥重要作用,故研究fgscs中的转录因子对于理解其基本特征有重要意义。白血病抑制因子(lif)是胚胎干细胞和雌性生殖干细胞培养过程中都需要的一种多功能外源生长因子,其生物功能包括促进原始生殖细胞的增殖、干细胞的干性维持,在胚胎干细胞中主要通过抑制es的自主分化实现。klf4基因是lif信号的下游效应基因,表达的klf4转录因子是体细胞重编程所需四个转录因子之一,并且在fgscs里有较高的表达量,对于fgscs的基本特征可能存在重要的影响。

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2. 研究的基本内容与方案

实验的主要内容:

1. 设计klf4基因的grna (向导rna)。

2. 构建质粒载体转染fgscs,完成对fgscs内的klf4基因的敲除。

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3. 研究计划与安排

第1-2周:调研阅读资料,准备开题
第3周:开题,准备实验用品。
第4-14周:实验,中间穿插资料重新检索、撰写论文等。
第15周:撰写毕业论文,答辩。

4. 参考文献(12篇以上)

zhang x l, wu j, jian w, et al. integrative epigenomicanalysis reveals unique epigenetic signatures involved in unipotency of mousefemale germline stem cells[j]. genome biology, 2016, 17(1):162.

young r a. control of the embryonic stem cell state[j].cell, 2011, 144(6):940-954.

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