摘 要

MPP 是MPTP的活性代谢产物，能产生对中脑黑质多巴胺能神经元的选择性破坏作用，二十多年来广泛作为诱导实验性PD实验模型的有效药物。PD的发生是遗传和环境因素综合作用的结果，发病机制涉及氧化应激、线粒体功能失调、蛋白质错误折叠和聚集、蛋白酶体功能紊乱、兴奋性毒性等多因素，至今PD的发病机制还不明确。本篇论文旨在通过急性MPP 模型与慢性MPP 模型作用特点的对比来探索最有效的PD致病细胞模型，并初步探索MPP 对细胞的损伤机制来研究PD的发病机制。在本论文工作中，主要是采用cck8法初步探索MPP 损伤的细胞的机制，并研究慢性MPP 细胞模型的作用特点及作用效果。

关键词：MPP ， 慢性PD模型 ，cck8检测细胞活力 ， 细胞损伤

Abstract

MPP is the active metabolite of MPTP and can produce selective destruction of dopaminergic neurons in the midbrain substantia nigra. It has been widely used as an effective drug for experimental PD model for more than two decades. The occurrence of PD is the result of a combination of genetic and environmental factors. The pathogenesis involves multiple factors such as oxidative stress, mitochondrial dysfunction, protein misfolding and aggregation, proteasome dysfunction, and excitotoxicity. Until now, the pathogenesis of PD has not been established. . This paper aims to explore the most effective model of PD pathogenesis by comparing the characteristics of the acute MPP model with that of chronic MPP models, and to explore the mechanism of MPP damage to cells to study the pathogenesis of PD. In the work of this thesis, the mechanism of MPP injured cells is mainly explored by cck8 method, and the function and effect of chronic MPP cell model are studied.

Keyword：MPP , Chronic PD model, cck8 detects cell viability, cell damage

目录

第一章绪论 1

1.1论文研究的背景与意义 1

1.2MPTP/MPP 诱导的PD实验模型的发展 1

1.3 MPTP/MPP 毒性作用机理 2

1.4目前PD模型的研究进展 3

1.5研究内容与技术路线 4

第二章仪器介绍及cck8法检测细胞活力 6

2.1试剂以及仪器 6

2.1.1试剂 6

2.1.2仪器 6

2.1.2 细胞间使用规范 6

2.2细胞培养过程 7

2.2.1细胞复苏 7

2.2.2细胞传板 8

2.2.3细胞冻存 9

2.2.4培养基的配置 9

2.3毒液介绍及稀释给药 9

2.4 cck-8法测细胞活力 9

2.4.1cck8法原理 10

2.4.2 CCK-8检测操作步骤 10

2.4.3 CCK-8使用注意事项 10

第三章MPTP诱导的细胞模型特点测定 12

3.1MPTP对细胞的毒性作用 12

3.2探索不同浓度梯度的MPP 对细胞的影响并选择最适宜的细胞毒液浓度实验方案 12

3.3 MPP 诱导的细胞模型在不同作用时间下的毒性作用特点 13

3.4 MPP 诱导的细胞模型对不同密度细胞的毒性作用特点 14

第四章结果和数据分析 16

4.1 MPTP损伤细胞活力 16

4.2 最适细胞浓度结果分析 16

4.3最适MPTP浓度结果分析 17

4.4时间变量系列实验结果分析 18

4.5 MPP 诱导的细胞模型对不同密度细胞的毒性作用结果分析 20

第五章结语 22

5.1主要结论 22

5.2 存在的问题以及进一步的展望 22

参考文献 23

致谢 24

第一章绪论

1.1论文研究的背景与意义

帕金森病是一种在65岁以上中老年人群中并不罕见的一种由神经系统病变失调引发的疾病。该疾病对运动系统，神经系统等造成不可逆的损害，可诱发脑部病变，得此病症的患者会出现非运动性震颤，肌肉僵硬，步态和姿势停滞等症状。PD 的最突出的病理特征为多巴胺能神经元的死亡和神经元中被称为“路易体”的蛋白质内含物的出现。作为一种高发的神经衰退类的疾病，PD的发病机制依旧未知。已知，作为研究PD的病理病因模型，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）[1]已较为普遍的应用于实验和研究过程中，MPTP发挥神经毒性作用如下:MPTP经由血脑屏障渗透进入神经胶质细胞内部，并在其中在单氨氧化酶的催化作用下发生相应的化学反应并转化形成它的有效成分1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP ）。MPTP及MPP 诱导的PD实验模型的创立有效的拉动了PD的发病机理及临床药物等方面的研究进展。现在国内外的研究模型分为慢性，亚急性和急性三种，其中最为常见的是急性模型。在急性和亚急性模型中，多巴胺能神经元在短时间内可丧失细胞活性，而且神经元中没有发现包涵体。而在慢性模型中，神经元细胞损伤死亡速度较慢且在其中形成了包涵体，因此更适合模拟PD的发病机理。除此之外，更加透彻有深度的研究指出，细胞的自噬机制在PD的病发过程中起到了不可小觑的协助作用。在细胞内的降解体系内，细胞质成分被递送至溶酶体的必需载体是自噬体的双膜囊泡。脑特异性自噬缺陷的小鼠表现出神经元细胞的死亡同时也伴随着蛋白质集体凝聚等现象，显示出神经退行性病症的症状。此类研究也都证实了神经退行性疾病（包括PD）有可能是由细胞自噬异样所引发的。同时，多个研究组发现：MPP 处理的神经元中出现了自噬体数量增加等现象。然而他们所提出的解释这个现象的原因却不同。其中一些解释为自噬体合成增强，而另一些解释为自噬体降解减少。这种差异也表明MPP 对自噬过程的促进或抑制作用有赖于处理条件或者是细胞类型。本文初步探索慢性PD模型的致病特点，并与急性PD模型对比，通过cck8来检测细胞活力，比较两者致病特点的异同，从而探索更有效的细胞模型。

1.2MPTP/MPP 诱导的PD实验模型的发展

1982年，一种新型的由芬太尼衍生物研制而成的致瘾性毒物在制造加工的过程中由于掺入了MPTP而被污染，美国加州的一些年轻人在服用这些药物后，不幸患有亚急性帕金森综合征，患者所呈现的症状与PD病人极其相似，都伴有运动不便，肢体僵硬，非运动性震颤等运动性病征。除此之外，研究人员还通过尸体检测发现了黑质损伤等特征。此药物引起了众多学者的关注，而随后的研究证实，MPTP能够有选择性地损害神经元活性和正常的生化反应，并能够致使与PD相类似的临床特点和病理变化。体外细胞培养模型由于稳定，经济，快速而逐渐被业界认可，成为研究PD病因学模型之一。体外培育的多种细胞在MPP 的作用下均能检测到细胞受损特征，这些都证明了,MPP 可突破以往模型的局限性，能够采取体外细胞培养的途径来进行PD疾病的研究，并发挥良好的神经毒性作用。因而MPP 能够在世界范围内普遍采用，成为一种实验效果较为优良的PD实验模型。

在MPTP应用于PD研究的初步阶段，科研人员探索的焦点在于急性模型。急性模型不仅可致使神经元变性死亡（PD的主要病理特征），并且也会导致与PD类似的其他症状。然而此类模型的一个严重缺陷则是无法观测到细胞表达α-突触核蛋白（α-SYN）和LB。虽然DA的显著缺失和黑质致密部渐进性缺失是帕金森病的主要病理特征，但神经元内的LB标志物的出现也是不可或缺的一项重要病理改变。LB最重要的组成部分是α-突触核蛋白，并且在PD病发的过程中，此种蛋白的产生和集聚起到了关键作用。PD在人体内的发病表现为慢性和渐进性两个主要特征，因此，MPTP/MPP 诱导的慢性PD模型得到了国内外学者的广泛关注，并且研究人员期望能得到更为稳定和LB/α-突出核蛋白可以可靠表达的细胞实验模型。随着相关研究的深入，学者们发现MPTP/MPP 诱导的急性模型和其亚急性模型均无法观察到神经元内的LB的出现，因此两者都不能成为有效的实验模型。最终在反复的探索和尝试之后，研究人员通过微量注入MPTP或者间隔一段固定时间注入MPTP成功制备了MPTP慢性PD动物模型。此类模型不仅能表现急性和亚急性细胞模型的某些症状，最为关键的是学者在此类模型中发现了α-突触核蛋白的集聚，除此之外，个别研究还证实了慢性模型中能够出现LB包涵体。至今，此类慢性模型成为最富有代表性且兼具稳定性和可利用性的PD模型。

1.3 MPTP/MPP 毒性作用机理

MPTP能特异性地损伤致死人和某些动物脑内存在于黑质—纹状体通路的多巴胺(DA)能神经,DA神经的坏死能诱发帕金森病的相关病症。目前，MPTP起作用的机理是较为容易理解和清楚明白的。其实MPTP的毒性作用是来自于其活性代谢产物MPP ，MPTP本身不具有毒性作用，但其脂溶性很好，所以可没有选择性的越过膜系统进入细胞内起作用。MPTP起作用的方式如下：单氨氧化酶B可在神经胶质细胞内将MPTP经氧化还原反应催化成1-甲基-4-苯基-2,3-二氢吡啶离子（MPDP ），在一系列自发氧化反应过后，MPP 形成并被释放到细胞外间隙，此后，位于突触前膜上的多巴胺转运体（DAT）能特异性携带MPP 进入黑质DA神经元细胞内。很多在啮齿类和非人类的灵长类PD模型[2,3]的相关实验证实，MPTP的代谢产物MPP 是真正的细胞毒性物质。DA是一种起到神经抑制作用的递质，MPP 在发挥作用的时候可在神经元内部通过抑制酪氨酸羟化酶的活性从而阻止DA的合成通道，致使通过黑质-纹状体束到达纹状体发挥活性的DA显著降低，起到降低DA抑制作用的效果。而这种抑制作用被降低到一定的限度，临床上就会呈现出PD的特征性症状。MPP 也可以通过阻断氧化磷酸化的方式来使细胞缺乏能量的供应而死亡。α-酮戊二酸脱氢酶复合体和线粒体复合物I（NADH脱氢酶）的作用活性会受到聚集在线粒体内膜上的MPP 的影响而显著降低，由于电子产生通路被阻截，电子链不能有效运作，从而损毁了三磷酸腺苷（ATP）的聚合反应和线粒体呼吸链的协同运作。ATP供应不足，ROS的过量合成，氧化应激反应和线粒体膜电位的失衡都会致使细胞死亡。除此之外，不少的研究已经说明，在PD渐进性发病的过程中，小胶质细胞的激活是不可忽视的关键步骤[4]。小胶质细胞可用于维持脑部神经的正常运作，但是如果小胶质细胞被过度活化则可致使DAergic神经元的损害[5]。过度活化的小胶质细胞会诱导活化一系列物质：一氧化氮合酶[6]，前列腺素E22（PGE2）干扰素-γ，等细胞毒性物质。缺乏NOS的转基因小鼠可有效抵制MPTP的神经毒性作用以及NOS抑制剂对MPTP的防护作用都能间接证实NO对于MPTP毒性作用的促进效用。此外，MPP 能引发谷氨酸盐浓度的局部骤升，间接使线粒体内的相关酶促反应无法正常进行，并且使得DA的氧化代谢运作速度加快，过氧化物，OH，NO等活性产物在短期内大量聚集在细胞质中，加速了DAergic神经元内的一系列氧化反应[7]，加重细胞衰亡。MPTP/MPP 诱导的PD实验模型对深入探究PD的发病分子和细胞层面的机理具有举足轻重的作用，同时这种模型能有效用于很多神经修复类药剂或治疗方法的选择和评价研究。

1.4目前PD模型的研究进展

从下表多种PD实验模型的分析可以看出，现阶段，各种PD模型都存在着各自的特点和相应的局限，没有一种模型是PD的理想实验模型。但从多种角度分析看来，现阶段最为理想和稳定的PD实验模型还是MPTP诱导的细胞毒性模型，MPTP的毒性机制的研究很好的推动了PD病理学和发病机理的探究发展。作为一种重要的实验方法，MPTP有效的用于了PD的预防治疗的筛选和评价。本文从MPP 对细胞的损伤机制入手来研究PD的发病机制，与最新的相关研究挂钩，这就使得该课题的意义更加深远，对该课题的实施也就显得更加有价值。而且在以往的基于MPP 的研究模型中提出了多个神经元细胞死亡的假设，但这些假设大多都建立在急性MPP 处理模型的基础之上。所以对于低浓度MPP 处理模型的研究的实际应用价值较高。

表1.1众多PD试验模型及比较

1.5研究内容与技术路线

基本内容：本实验的主要目的为探索MPP 对细胞活性的损害机制来研究PD的致病和渐进性发病机理[10]。国内外的研究已经指出，神经元对于各浓度的MPP 的反应敏感程度显著不同。所以介于PD的缓慢发病机制，低浓度的MPP 处理的细胞模型可能对于PD的研究贡献更大。因此，实验最先探究了低浓度MPP 处理的细胞与急性高浓度MPP 作用的细胞活性的异同来证明低浓度MPP 的在研究PD致病机理方面的效用[12,13]。

具体实验操作为：将细胞暴露于预定浓度的MPP 达24小时或48小时，之后使用cck8法来检测细胞活性。为了进一步阐释两种模型的毒性差异，将各种密度的细胞（分为 3*10⁴cells/cm²，6*10⁴cells/cm²，9*10⁴cells/cm²三个密度梯度来进行研究。）分别用低浓度MPP （48小时）和高浓度MPP （24小时）进行处理和检测细胞活性。

第二章仪器介绍及cck8法检测细胞活力

2.1试剂以及仪器

2.1.1试剂

DMEM培养基：DMEM培养基是一种含各种细胞生长所需的氨基酸和葡萄糖的基本培养基之一，在本次实验中用于给小鼠神经细胞提供营养供其生长。

FBS：即胎牛血清，颜色为浅黄色，是一种含有多种对细胞毒害作用很小的抗体和补体的澄清略粘稠液体。

PS：即双抗，是一种普遍应用于细胞培养的青链霉素混合液，加入到细胞培养液中用于抑制细菌繁殖，防止细胞污染。

胰酶溶液：发挥酶解作用使细胞分散呈现圆球状以便于细胞稀释传板，可用DMEM培养基终止消化。

MPTP溶液（100毫摩尔每升）

CCK-8试剂盒

PBS：主要用于培养基的冲洗和注入96孔板防止边缘效应。

2.1.2仪器

CO₂培养箱：通过模拟形成一个类似细胞在生物体内的生长环境，主要用于放置96孔板和培养皿，使细胞有一个稳定生长的环境，培养箱要求几乎恒定的适宜的温度，适合细胞生长的酸碱度，优良的相对饱和湿度，稳定的二样化碳浓度。

离心机：主要用于细胞复苏和冻存，将细胞沉降到试管底部。

水浴锅：主要用于孵育培养基胰酶。

超净工作台：超净工作台是无菌的高洁净工作环境，主要进行细胞传代，药物稀释和CCK-8检测等试验步骤，在使用过程中，在进行实验操作的前30分钟应预先打开紫外灭菌灯，使用结束后，应用酒精棉球擦拭工作台面，从而保证台面没有废液残留。

酶标仪：主要用于放置96孔板检测OD值（OD值的大小反应细胞的相对活力）。酶标仪的主要的检测原理是运用比色法测量溶液的吸光度，与分光光度计的核心原理大致相同。

2.1.2 细胞间使用规范

细胞间使用规范

安全制度：

1.如果不小心导致超净工作台内的酒精起火，应及时把隔板拉下，将风机关闭，防止火势蔓延到工作台以外，此时不要过于惊慌，千万不可把酒精灯碰洒，导致更多的酒精溢出。

2.水浴锅和培养箱中的水应每间隔2个星期用灭菌后的去离子水更换一次。

3.CO₂气体的换瓶及购买工作应交由专门的人员负责。

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