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藜属WRKY基因家族的进化与鉴定

摘要

WRKY基因家族在植物抗逆性中起着独特的作用。藜麦是一种世界性的栽培作物，以其耐受性好而闻名。奎奴亚藜WRKY基因家族尚未被研究。采用全基因组搜索方法，在15种植物、7种动物和7种真菌中鉴定出1226个WRKY基因。WRKY蛋白在动物和5种真菌中均未发现，但在陆地植物中广泛存在。本实验共鉴定了92个CqWRKY基因，在系统发育分析的基础上，将这些CqWRKY基因分为三类。CqWRKY蛋白具有高度保守的七肽WRKYGQK和15个保守元件。此外，共有25个CqWRKY基因参与了器官发育和渗透胁迫的共表达途径。这些CqWRKY基因一半以上的表达水平在盐胁迫或干旱胁迫下表现出显著差异。本研究首次报道了藜麦CqWRKY基因家族在全基因组水平上的发现。这些信息将有助于我们了解藜麦等作物抗逆性的分子机制。

1.导论

WRKY基因家族是一种重要的转录因子，在植物对非生物和生物胁迫的防御反应中发挥着独特的调控作用，它们可以对其他基因的表达产生积极或消极的调控作用，从而提高植物的抗逆性。在野生二倍体林地草莓中，在白粉病、盐、干旱、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)处理下，FvWRKY 42表达，与不同的应激反应蛋白相互作用。FvWRKY 42在拟南芥中的过表达增强了白粉病抗性、耐盐性和抗旱性。以前的研究还发现，葡萄中的VvWRKY 30对盐胁迫有积极的影响，转基因拟南芥通过调节一系列乙二醇代谢依赖基因而具有超盐胁迫抗性。ZmWRKY 40和ZmWRKY 106分别在盐、干旱、ABA和高温条件下诱导玉米生长。与野生型相比，ZmWRKY 40过表达调控拟南芥和水稻中不同的胁迫相关基因，包括STZ、DREB2B和RD29A，以提高抗旱性和耐热性，而ZmWRKY 106的过表达则调控ABA信号通路相关基因的表达，从而提高抗旱性和耐热性。此外，GmWRKY 27还可以与GmMYB 174进行交互，并抑制GmNAC 29的表达。GmWRKY 27的过表达和基因敲除表明它在大豆盐胁迫和干旱胁迫中起着重要的作用。WRKY转录因子在调控转基因作物产量中也起着重要作用。例如，Gao等人报告说，过表达TaWRKY 2可显著提高转基因小麦的产量，与野生型小麦相比，转基因小麦穗长较长，穗粒数较多。在水稻中，OsWRKY 47的基因敲除表现出较低的耐旱性，降低了产量，而过高表达的OsWRKY 47则提高了水稻的耐旱性。在缺磷胁迫下，OsWRKY 74高表达植株的分蘖数、粒重和磷浓度也显著增加。

一般来说，WRKY蛋白有60个氨基酸结构域，称为WRKY结构域。这些结构域与C端的锌指基序(Cys2-His2)共同作用于N-端的DNA结合肽序列WRKYGQK.WRKY结构域与目标基因启动子中的一个称为W盒(TGACC(A/T)或确定(顺式应答元件)的DNA基序特别相互作用，然后调控它们的生物和非生物胁迫反应。根据锌指基序的序列特征和WRKY结构域的数目，进一步将WRKY基因分为三类：WRKYⅠ、Ⅱ和Ⅲ。第一类成员具有C2H2(C-X4-C-X22-23-HXH)锌指基序和两个WRKY结构域。第二组成员的锌指基序与第一组相似，但只有一个WRKY结构域。第三组的所有成员都含有C2CH(C-X7-C-X23-HXC)基序和一个WRKY结构域。第二类可进一步分为五个亚组：Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d和Ⅱ-e。WRKY基因家族在调节发育和多种生理过程中发挥着独特的作用。例如，在拟南芥中，在非生物胁迫下，WRKY 75的表达受到抑制，侧根数和根长显著增加。同样，Ⅰ类WRKY基因GhWRKY 25是从棉花中克隆出来的，在非生物胁迫下，GhWRKY 25的表达水平降低。GhWRKY 25的过表达不仅通过降低SA或ET信号相关基因的表达，提高了烟草对真菌病原菌灰霉葡萄孢的敏感性，而且降低了对干旱胁迫的耐受性。在干旱或盐胁迫下，蚕豆各器官VfWRKY 1和VfWRKY 2的表达水平显著提高。此外，茶树CsWRKY 2在茶树(Camellia sinensis L.)CsWRKY 2通过参与ABA信号转导途径在冷胁迫或干旱胁迫中发挥重要作用.

WRKYⅡ和Ⅲ蛋白在叶片衰老和植物胁迫响应中起着重要作用。WRKY转录因子WRKY 6和WRKY 11在拟南芥叶片衰老中起着重要作用。相比之下，WRKY Ⅲ成员WRKY 54和WRKY 70作为叶片衰老的负调节因子。MtWRKY 76在水稻棉花中的过表达也被报道增强了它们的耐盐性和耐旱性。此外，WRKYⅢ蛋白可与其他基因启动子区的顺式元件结合，以增强其在致病胁迫下的表达.

藜(藜麦属)是世界上最古老的栽培作物之一。它最初是在7000多年前在南美洲作为主食而被驯养的。藜麦的谷物对人类和动物具有很高的营养价值。蛋白质、总脂肪和膳食纤维含量分别为9.1-15.7 g、4.0~7.6 g、8.8~14.1g/100 g鲜藜粒。

植物全基因组序列可用于基因家族的鉴定，WRKY蛋白已在多种植物物种中得到广泛的鉴定。利用HMMER搜索程序，在水稻中发现了102个WRKY基因，在高粱和77个花生品系中检测到32个WRKY基因。然而，到目前为止，WRKY基因家族在藜麦中的作用/功能尚不清楚。在此，我们系统地对藜麦WRKY基因家族进行了全基因组搜索，并鉴定了CqWRKY与其它植物WRKY的进化关系。分析了WRKY蛋白的系统进化关系、保守基序、亚组分类、调控网络以及WRKY蛋白的表达模式。这些结果将有助于我们了解藜麦等作物抗逆性的分子机制。这些结果不仅为进一步的功能分析提供了潜在的可能选择，而且也有助于我们了解藜麦及其它植物抗逆性的分子机制。

2.材料与方法

2.1WRKY基因家族的鉴定及染色体定位

从NCBI下载动物和真菌蛋白序列，从Ensembl plants下载植物蛋白序列(http://plants.ensembl.org/index.html)，从植物数据库(http://www.phytozome.net/)和NCBI下载藜麦基因组和蛋白质序列，并筛选WRKY蛋白序列以鉴定WRKY基因。首先利用这些蛋白质序列建立本地数据库。然后根据拟南芥中已知的WRKY蛋白序列对数据库进行搜索。在我们的数据库搜索中，我们使用了本地的BLASTP程序(E值截断lt;1e-5的https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)。人工处理后，从PFAM31.0数据库(http://pfam.xfam.org/)和HMM 3.2软件中获得保守WRKY结构域(PF 03106)序列的隐马尔可夫模型(HMM)谱(用http://hmmer.org/)搜索15种植物、7种真菌和7种动物的所有WRKY蛋白)。利用DNAMAN5.0(LynnonBioSoft, Quebec, Canada)，从含有完整WRKY结构域的蛋白质序列中去除冗余序列和不完全剩余序列。利用ExPASy在线数据库计算了藜属各WRKY的分子量、氨基酸长度和等电点。应用Cello v2.5、pLoc-mprint(http://www.jci-bioinfo.cn/pLoc-mPlant/)和PSORT(https://psort.hgc.jp/)对这些CqWRKY蛋白的亚细胞定位进行预测。所有参数都设置为默认参数。利用BLASTN 2.8.1定位程序(NCBI，BASSDA，MD，USA)将基因组定位在藜麦基因组的支架和染色体上，E值lt;10minus;5，获得了最佳的定位结果。

2.2.系统发育分析、基因结构、蛋白质保守基序鉴定及基因复制

ClutsalW1.83程序用于植物、真菌和动物之间的多个蛋白质序列比对。利用MEGA6.0(Phoenix, AZ, USA)建立了具有1000个自举复制的近邻连接(NJ)系统发生树。

在藜麦中，利用模因MEME(Motif Elication，http://meme-suite.org/tools/meme)对CqWRKY的保守基序进行了研究，其参数设置如下：重复单元数设为任意，最大基序设置为15，最佳模宽设置为6-200个残基。从藜麦基因组数据库中获得CqWRKY基因的内含子、外显子和基因组定位等基因结构信息，并在GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)中显示。对藜属WRKY基因的复制进行了研究。满足三个标准：序列覆盖长度的80%以上，同源性gt;80%，紧密连锁的基因被认为是一个重复。然后，利用Circos工具(藜麦基因组中的http://circos.ca/)对重复区域进行可视化。

2.3.CqWRKY基因的相互作用网络

为了研究CqWRKY基因的调控作用，在拟南芥与藜麦的同源比较基础上，构建了CqWRKY与其他藜麦基因的交互调控网络。用String v10.5(http://string db.org/)和AraNet V2(https://www.inetbio.org/aranet/)工具)分析拟南芥同源基因。Cytoscapev3.2.1(San Diego, CA, USA)和BiNGO3.0.3(https：/www.psb.ugent.be/bbd/documents/bingo/home.html)被用来绘制CqWRKY蛋白的图谱，并构建特定基因的生物相互作用途径。

2.4.TaHDZ基因在不同组织和不同非生物胁迫下的表达谱分析

公开提供的藜麦RNA-seq数据集来自SRA(Sequence Read Archive序列读取存档，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra).)。对已鉴定的CqWRKY基因的表达模式进行了分析。以干燥种子(SRS 2464892)、1周龄幼苗(SRS 2434487、SRS 2464890)、叶片(SRS 4026093、SRS 4026094、SRS 4026095)、茎(SRS 2464891)和花序(SRS 2464889)为材料进行组织特异性表达谱的鉴定。采用盐胁迫处理(SRS 2458686、SRS 2458681、SRS 2458685)和干旱胁迫处理(SRS 1204205)检测胁迫响应基因。用R软件3.5.1(https://www.r-project.org/)中的热图开发软件包对表达水平进行归一化，用log 10变换生成热图。

3.结果

3.1.真核生物到植物WRKY蛋白的全局鉴定与进化

为了了解WRKY的进化历史和亲缘关系，我们对15种有代表性的植物种、7种动物种和7种真菌物种(表A1，补充材料1)进行了HMM分析和BLASTP分析，共鉴定出1226个WRKY基因。结果表明，7种动物，包括扁虫、软体动物、马毛虫、鱼类、两栖动物和爬行动物，均未发现WRKY蛋白。此外，5种真菌均未检出WRKY蛋白。然而，在青根霉和盘藻中分别发现了5种WRKY蛋白和1种WRKY蛋白。五种来自奇根霉的WRKY蛋白有一个WRKY结构域，一个WRKY蛋白有两个WRKY结构域。这种现象在蓝贾第中也有发现。以15种植物为材料，包括双子叶植物3种、裸子植物2种、单子叶植物5种、蕨类植物1种、苔藓植物2种、藻类2种。结果表明，WRKY在陆地植物中广泛存在。其中被子植物的WRKY基因最丰富，其次是裸子植物、蕨类植物和苔藓植物。特别是在小麦中发现了296条WRKY基因。这些主要是WRKY基因家族的物种之间的这种差异确实随着小麦多倍体化和基因组进化而扩大。与其它植物相比，藻类中WRKY基因的数量特别少。有趣的是，衣藻的进化是在陆地植物分化之前，因此我们发现只有两个WRKY蛋白被鉴定并分类为I组。同时，在团藻中发现了两个WRKY蛋白(图1)。这种现象可能是由于藻类只有一个拷贝，所以WRKY基因复制事件发生在从低级到高等植物的进化过程中。

此外，还调查了这些物种的每个亚组的WRKY数量(图A1-A9)。在单子叶植物中，除藜属外，Ⅲ组为较大的亚组，而Ⅱ-c组为双子叶和裸子植物的较大亚组，除梭子植物外，其余均为裸子植物。Ⅱ-a组只存在于被子植物和裸子植物中，而不存在于古代植物中，Ⅲ组出现在蕨类植物的进化早期，在被子植物、裸子植物和蕨类植物中得到保护(图1)。

3.2.藜属WRKY基因的鉴定

共鉴定出92个含有完整WRKY结构域的非冗余基因.这些蛋白序列被命名为CqWRKY1A到CqWRKY58A，被认为是藜麦WRKY基因。这些WRKY基因有很大的组成差异，分子量为21.8~91.0 kDa，长度为191~639个氨基酸，等电点为5.3~9.8。其中86种CqWRKY位于细胞核内，胞外仅有CqWR

资料编号：[3470]