摘 要

如今，纳米材料越来越广泛地应用于生活及科研领域，但纳米材料的大量使用对环境造成了严重的影响，如废弃的纳米材料难以回收，不仅占用了土地资源，还易分散到水里，对水生态系统造成污染。本实验以莲为实验材料，利用纳米银对莲进行一定时间的暴露处理，通过荧光定量PCR检测莲胁迫相关基因的表达变化情况，探索纳米银对高等植物在分子水平的影响机制。

实验结果表明，纳米银会对莲造成胁迫且浓度为5 mg/L时影响最大。另外，纳米银的处理时间也是影响胁迫相关基因表达变化的重要因素。在纳米银处理环境下，莲中光合相关rbcL基因的表达量呈先上升后下降的趋势，rbcS基因的表达下调，Rubisco酶活性下降，光合作用受到抑制。为了抵御纳米银造成的氧化胁迫，GSH1基因表达水平显著上调，GR基因发挥辅助作用，促进GSH的合成。同时，转录因子WRKY70a和WRKY70b在莲抗纳米银胁迫过程中具有调控作用，其中WRKY70b转录因子起主导作用。

目前，纳米材料生物效应的研究主要集中在动植物生理生化层面，本研究对初步阐明植物抗纳米材料胁迫的分子机制具有重要意义。

关键词：纳米银；莲；胁迫；基因表达；荧光定量PCR

Abstract

Nowadays, nanomaterials are more and more widely used in the field of life and scientific research. However, the extensive use of nanomaterials has caused serious impacts on the environment. For example, waste nanomaterials are difficult to be recycled, which not only occupy land resources, but also easily disperse into water, causing pollution to the water ecosystem. In this experiment, lotus was exposed to silver nanoparticles for a certain period of time, and the expression of stress-related genes in lotus was detected by real-time quantitative PCR, so as to explore the influence mechanism of silver nanoparticles on higher plants at the molecular level.

The results showed that the lotus was stressed when treated by nano silver solution, and this stress effect was the most obvious when the concentration was 5 mg/L. In addition, the processing time is also an important factor affecting the expression of stress-related genes. The expression level of photosynthesis-related gene rbcL in lotus increased at first and then decreased, rbcS gene was down-regulated, resulting in the decrease of Rubisco enzyme activity and photosynthetic rates. To avoid the oxidative stress induced by nano-silver, the expression level of GSH1 gene in lotus was significantly up-regulated whereas GR gene played a secondary role in promoting the synthesis of GSH. Meanwhile, both WRKY70a and WRKY70b TFs in lotus play regulatory roles in the resistance to nano-silver stress, and WRKY70b TF is more important in this process.

At present, the research on the biological effects of nanomaterials mainly focuses on the physiological and biochemical aspects. This study is of great significance for the preliminary elucidation of the molecular mechanism of plant resistance to the nano-stress.

Key words: Silver nanoparticles; Lotus; Stress; Gene expression; Real-time quantitative PCR

目录

第1章 绪论 1

1.1 纳米材料简介 1

1.2 纳米银概述 1

1.3 纳米银生物效应研究进展 2

1.4 水生植物莲与纳米银 3

1.4.1 莲的概述 3

1.4.2 莲中抗纳米银胁迫相关基因功能简介 3

1.5 研究内容及技术路线 5

第2章 材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 植物材料 7

2.1.2 实验主要试剂 8

2.1.3 实验主要仪器 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 莲幼苗处理与样品采集 9

2.2.2 提取及检测莲叶RNA 9

2.2.3 反转录合成cDNA 9

2.2.4 获取莲胁迫相关基因的核苷酸序列 10

2.2.5 设计引物 10

2.2.6 荧光定量PCR检测 11

2.2.7 数据处理 11

第3章 结果与分析 12

3.1 引物设计及分析 12

3.2 莲叶RNA的检测及质量分析 14

3.3 实时荧光定量PCR分析 17

3.3.1 光合相关基因表达谱分析 17

3.3.2 抗氧化胁迫相关基因表达谱分析 18

3.3.3 转录因子WRKY家族基因表达谱分析 19

第4章 结论与展望 21

参考文献 22

致谢 26

绪论

纳米材料简介

在人们物质需求日益增长和社会飞速发展的双重背景下，纳米材料（nanomaterials，NM）逐渐出现在大众的视野中。纳米材料是一种以纳米尺寸（1-100nm）为基本单位制成的特殊材料具有尺寸小、表面能高的特点，在力学、热学、电学、磁学、催化等方面有着突出的性能^[1-3]。目前，纳米材料已成为与人们日常生活以及科学领域密切相关的一部分。在生活中，纳米复合材料具有较稳定的物化性质和抗菌性，成为食品包装行业的新型材料。不仅如此，一些纳米材料，如纳米银，可以催化乙烯氧化反应，从而降低食物中乙烯的含量，实现食品的保鲜^[4]。在医药行业，纳米金属材料因其良好的导电性和生物相容性被应用于医用传感器的制作，该传感器具有较高灵敏度和较长使用寿命^[5]。纳米材料还能用于细胞的染色与分离，在临床诊断中也具有重大意义^[4]。在能源转化方面，纳米材料也扮演了重要的角色。碳纳米管的层状纳米级结构能提高贮锂量，是锂离子电池的新兴负极材料。碳纳米管复合材料能够提高光电转化效率，且材料成本低、来源广、无污染，可用于太阳能电池的制备^[6]。

纳米银概述

纳米银（AgNPs）是粒径为纳米级的金属银单质，它的粒径一般在25-50nm之间。AgNPs作为一种常见的纳米材料，因其诸多优异的性能，被广泛应用于工商业、手工业、医药业以及电子信息等各行各业中。AgNPs有着突出的导电性。银是导电性能最好的金属，利用AgNPs可以制备导电银浆，而具有高导电性能的导电银浆也逐渐成为各种电子元件的主要功能材料^[7]。林丽等制备了纳米银胶标记的DNA电化学传感器，相较于普通DNA传感器，它不仅响应快、灵敏度强，而且稳定性好、选择性高，适用于DNA序列的检测与分析^[8]。另外，AgNPs的抗菌能力同样突出。蒋琪霞等发现长期使用AgNPs作为慢性伤口敷料能抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌等细菌的生长，降低病原菌阳性率，有效且安全^[9]。郑辉东等把AgNPs颗粒负载在乙烯-醋酸乙烯共聚物（EVA）复合发泡材料的表面，通过抗菌实验，发现该复合材料在经过50次的洗涤后，对大肠杆菌的抗菌率达到98%，对金黄色葡萄球菌的抗菌率达到99%。因此，EVA复合发泡材料在负载AgNPs颗粒后具有良好的抗菌持久性^[10]。AgNPs不仅具有导电性和抗菌性，其显著的催化性也被前人证实^[11-12]。闫江梅等以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)保护的AgNPs作为催化剂，发现其能够催化正十二烷基硫醇、正丁硫醇和正辛硫醇的氧化偶联反应^[13]。米贺等通过浸渍、吸附等一系列步骤制备了AgNPs/介孔氮化碳复合微粒，发现该复合颗粒对对硝基苯酚(4-NP)的光解和还原反应有高效催化性，AgNPs在这一过程中表现了极大的光催化活性^[14]。近年来，表面增强拉曼散射(Surface Enhancement Raman Scattering，SERS)成为了众多学者的研究热点。而AgNPs作为SERS的基底，具有较强的SERS活性，可用于SERS光谱的测试^[15]。曲文刚等以AgNPs作为基底，利用表面增强共振拉曼散射（SERRS）检测水中的甲醛含量。这种方法可以广泛用于天然水域的检测，其检出限远远超出传统方法，实现了对于水体中甲醛含量的超灵敏检测^[16]。

纳米银生物效应研究进展

随着AgNPs产品的使用，越来越多的AgNPs颗粒释放到了自然环境中，并通过降雨、沉降、富集等方式汇聚进入水体。但AgNPs颗粒在水环境中难以降解，成为了潜在的持续性污染源，对水生生态系统造成了一定的威胁^[17]。因此，AgNPs的毒性开始受到人们的重视。Hussain等对不同种类的纳米粒子进行了潜在毒性的评估，发现AgNPs与MoO₃、Fe₃O₄、TiO₂等金属氧化物纳米颗粒和Al、Au等金属纳米颗粒相比，具有更强的毒性^[18]。前人通过微观研究，观察到在高剂量AgNPs的处理条件下，大鼠肝源性细胞发生皱缩后出现不规则的形状^[18]。周艳君等研究发现，经AgNPs暴露处理的青鳉体内金属银含量明显升高，其肝脏和鳃中的SOD值低于对照组，推测AgNPs对青鳉具有亚慢性毒性^[19]。黄俊等以中肋骨条藻作为实验材料，发现AgNPs的毒性与纳米颗粒自身粒径大小、包裹物的种类以及环境条件息息相关。随着实验的深入，研究者发现AgNPs对微藻具有多层次毒性的影响，并推测AgNPs对藻细胞的毒性机制可能是通过活性氧介导的氧化损伤和光合作用相关基因的调控来实现的^[20]。Jiang等发现高浓度AgNPs会抑制紫背浮萍光合作用的能力，导致糖含量降低^[21]。Mirzajani等在水稻中也得到了相同的结论^[22]。Yin等通过研究11种湿地植物，发现AgNPs对植物的萌发有一定程度的影响^[23]。AgNPs不仅能够影响植物的发芽率，还影响了小麦、黑麦草等植物的根长、株重等生物量^[24-25]。这些研究结果都表明AgNPs对动植物产生了一定影响。目前，关于AgNPs生物效应的研究仍主要集中在动植物生理生化层面，对于分子水平的研究尚少。

水生植物莲与纳米银

莲的概述

莲（Nelumbo nucifera Gaerth）是一种历史悠久的大型挺水植物，它分布于北半球的诸多水域^[26]。自古以来，莲被冠以“花之君子”的称号，它出现在了很多文人墨客的诗作中，《爱莲说》称赞其“出淤泥而不染，濯清涟而不妖”。莲浑身是宝，它的莲子、莲藕，甚至是莲叶和莲花，都可以供人食用。莲不仅可以作为食材，还可以作为药材，《神农本草经》中记载：“主补中养神，益气力，除百疾。久服，轻身耐老，不饥延年”。莲生物碱具有抗炎、抗氧化、抗心律失常、降脂降压等药理作用，潜力无限^[27]。中国著名的莲有湘莲、鄂莲、赣莲和建莲等，其中位于福建省建宁县的莲称为‘建莲’，其外观粒大而饱满，质量良好且具有较高的药用价值，被誉为“莲中极品”^[28]。

莲是代表性的水生植物，是我国重要经济作物，其生长环境特殊，主要生长在河流、湖泊等浅水地带，容易成为某些污染源比如AgNPs的蓄积生物。因此，研究AgNPs颗粒对莲产生的影响是很有必要的。目前，纳米材料的植物生物效应相关研究主要集中于生理生化层面，但在分子层面的研究，特别是纳米颗粒对水生植物在基因层面的影响以及水生植物抵抗纳米颗粒非生物胁迫的分子机理都未被揭示。在纳米颗粒胁迫条件下，莲的抗性基因将作出响应来减免自身伤害。

莲中抗纳米银胁迫相关基因功能简介

莲尽管作为一种人们熟知的经济作物，但是有关莲的分子生物学研究还相对匮乏。我们通过模式植物拟南芥中的抗性基因序列在莲基因组数据库进行同源搜索，得到了莲中与抗性相关的基因序列，基因的功能可由拟南芥中同源基因功能来推测。这些抗性基因分为抗活性氧损伤相关基因、光合作用相关基因以及转录因子家族基因等三类。