摘 要

不同发酵工艺参数的改变对生产菌的代谢活动影响各不相同。影响微生物发酵积累代谢产物产物产量的因素有很多，如培养基组分、温度、pH等，这些工艺参数的优化可以提高发酵产率与降低成本。本文主要研究了发酵培养基中pH变化、酵母提取物（YE）含量以及2-吗啡乙磺酸（MES）含量改变对Clostridium ljungdahlii菌株在合成气中生长以及代谢生成产物乙醇产量的影响。本研究分别考察了单一变量pH、YE与MES含量改变对C. ljungdahlii菌株生长和代谢的影响，同时通过交叉实验获得三个变量之间的相互影响，探索能够工业化应用的低成本高产值C. ljungdahlii合成气发酵培养基。

研究结果表明：低pH抑制菌体生长和乙醇产生，pH接近中性条件下乙醇产量最高，达到19.4 mmol/L，较实验最低值4.8 mmol/L提升了4倍。提高YE浓度有利于菌体生长但降低了乙醇的产量，提高MES浓度则可以提高乙醇产量。在pH值为5.8、最低测试YE浓度并完全移除MES条件下，培养基成本最低，C. ljungdahlii在合成气发酵所产生的乙醇产量为13.6mmol/L，这是目前实验室发酵级别条件下得到的适用于C. ljungdahlii的最具有工业化应用前景的低成本高乙醇产量培养基。

关键词：合成气发酵；Clostridium ljungdahlii；pH；2-吗啡乙磺酸；酵母提取物；

Abstract

The effects of different fermentation parameters on the metabolic activities of producing bacteria are different. There are many factors affecting the yield of metabolites accumulated by microbial fermentation, such as medium composition, temperature, pH and so on. The optimization of these process parameters can improve the fermentation yield and reduce the cost. The effects of pH, yeast extract (YE) and 2-morphine ethylsulfonic acid (MES) on the growth of Clostridium ljungdahlii strain in syngas and ethanol production were studied. In this study, the effects of single variable pH, YE and MES on the growth and metabolism of C. ljungdahlii strain were investigated. At the same time, the interaction of three variables was obtained through cross-experiments, and the low-cost and high-yield C. ljungdahlii syngas fermentation medium was explored.

The results showed that low pH inhibited the growth of bacteria and ethanol production, and the ethanol yield reached 19.4 mmol/L when the pH was close to neutral, which was 4 times higher than the experimental minimum value of 4.8 mmol/L. Increasing YE concentration is beneficial to the growth of bacteria but reduces ethanol production. Increasing MES concentration can increase ethanol production. Under the conditions of pH 5.8, minimum YE concentration and removal of MES completely, the cost of culture medium is the lowest. The ethanol yield produced by C. ljungdahlii fermentation in syngas is 13.6 mmol/L. This is the most low-cost and high-yield ethanol culture medium suitable for C. ljungdahlii, which is obtained under the condition of laboratory fermentation level.

Key Words：Syngas fermentation; Clostridium ljungdahlii; pH; MES; YE;

目 录

第1章 绪论 1

1.1 研究背景 1

1.2 燃料乙醇的发展概况 2

1.2.1 燃料乙醇在国外的发展概况 2

1.2.2 燃料乙醇在国内的发展概况 2

1.3 乙醇制备方法概况 2

1.3.1 化学合成法制取乙醇 2

1.3.2 生物发酵法制取乙醇 3

1.3.3 合成气厌氧发酵菌株概述 5

1.3.4 合成气转化乙醇的代谢途径 5

1.3.5 厌氧发酵制乙醇过程的主要影响因素 7

1.4 本课题的目的与意义 8

1.5 本课题的研究内容 8

第2章 初始条件测试野生型菌种基础生长及厌氧发酵产乙醇能力 9

2.1 材料与方法 9

2.1.1 菌株 9

2.1.2 合成气成分 9

2.1.3 设备 9

2.1.4 培养基配置 9

2.1.5 菌株接种 9

2.1.6 实验设计 10

2.1.7 产物测定方法 10

2.2 结果与分析 10

2.2.1野生型菌株（WT）生长曲线测定 10

2.2.2 产乙醇及乙酸能力测定 11

2.3 本章小结 12

第3章 交叉实验测试不同工艺条件对野生型菌种的影响 13

3.1 材料与方法 13

3.1.1 菌株 13

3.1.2 合成气成分 13

3.1.3 设备 13

3.1.4 培养基配制 13

3.1.5 实验设计 13

3.1.6 产物测定 14

3.2 结果与分析 14

3.2.1 pH、YE和MES浓度改变对生长影响 15

3.2.2 pH、YE和MES浓度改变对乙醇产量影响 16

3.3 本章小结 18

3.4 讨论 18

第4章 结论与建议 20

4.1主要结论 20

4.2 建议 20

参考文献 22

致 谢 25

第1章 绪论

1.1 研究背景

能源是人类社会文明进步的重要推动力。自人类开始使用生物质燃起第一簇火焰，我们就开始了不断的探索和使用着身边的一切可利用资源，也正是在各种不断发现的新能源推动下使得文明的马车不断前行。从人类发展的文明时间轴上看，重要的能源突破主要有三次：蒸汽机、电能和原子能。由不可再生的煤燃烧推动的蒸汽机演变为各种能源转化的清洁电能再到全新的更为高效清洁的原子能，我们在不断探索中也逐渐意识到了不可再生能源的珍贵和发展瓶颈。毋庸置疑，可供利用的矿物燃料用一份便少一份，但是日益增长的能源需求与新能源开发利用的困难却迫使着人类加大对廉价化石能源的使用。

能源危机迫在眉睫^[1]，大力发展高效可再生清洁能源是赢下这场能源战争的制胜法宝。风电、水电、太阳能发电及地热发电等清洁电能是发展新能源的重要选择方向，有效的收集和转化零散能源（如水力、风力、潮汐能和地热等）输出为稳定电能以供消耗，这方面已经有很多成功的案例。以核能作为能源转化为电能显得更为稳定与高效，但是却有着比太阳能等发电更为致命的局限，收集零散能源的最主要局限就在其不稳定性与占地面积广阔，然而核能发电其安全性却受到广泛质疑，同时核能发电所需要的技术较其他技术来说更难以扩大化发展，从而局限了核能的广泛性利用。除去这些先进的新能源技术，扎根于我国农业大国的国情来看的话，从《可再生能源中长期发展规划》可以看到我国最原始的生物质利用也是一个不可忽视的发展方向。现阶段对于废弃生物质的主要处理就是集中回收以燃烧发电或者堆肥反哺田地，但是如此粗略的利用方式带来的却是利用率低，浪费了很大一部份的潜在能源。在国外，针对废弃生物质的处理可以带来更高的收益，不管是对于环境保护还是能源转化来说。在我国，废弃生物质中主要是农业资源（如秸秆或稻壳等）、林业资源（如木屑或树皮等）与固体废物（生活垃圾等），如此庞大数量的生物质废弃物给环境保护带来了压力，却也是新能源发展的契机。利用废弃生物质不仅可以产生电能，同时还可以解决现阶段运输燃料的高需求问题。

石油能源需求加剧而产量不足对现有消耗石油衍生物的设备如汽车等的影响十分明显的，油价上涨暴露的是我国石油对外依存度太高，不利于国家能源安全。面对严峻的能源问题，尤其是石油的需求不断增加带来的高成本问题，如何解决或替换石油产品的使用吸引了越来越多的科研工作者投入钻研，以开发具有与石油衍生化石燃料相类似的物理、化学和燃烧性能的生物燃料。燃料乙醇因其高燃烧值以及可作为燃油品质改善剂在现阶段已经有部分国家投入使用，但是在我国的发展还处于慢慢摸索之中。

1.2 燃料乙醇的发展概况

1.2.1 燃料乙醇在国外的发展概况

源于上个世纪七十年代中期油价暴涨导致外汇收入的大额减少以及其庞大的甘蔗种植产业为依靠，巴西早在1973年便开始了燃料乙醇的大规模开发与利用研究。通过对燃料乙醇的开发与利用进行一步步的政策保障和技术保障之后，巴西成为了世界上第一个达到生物燃料可持续化利用和唯一一个不使用纯汽油为汽车燃料的国家，而且不局限于自己国家内部广泛使用乙醇，还大量出口成品燃料乙醇^[2]。燃料乙醇在美国的发展历程颇为坎坷，起源于20世纪初的运输使用，美国的一些早期发动机设计中就包含了以乙醇为燃料的机型，但是高昂的乙醇税收遏制了燃料乙醇的发展。然而在2000年发现汽油添加剂中的甲基叔丁基醚（MTBE）对人体健康有害，便将生物乙醇作为替代物使用。同时在面对20世纪70年代的石油危机时，美国政府将目光重新聚焦在了生物乙醇身上，利用广泛种植的转基因玉米作为原料大力发展燃料乙醇。领先于世界水平的研究能力牵引着美国的燃料乙醇发展，其燃料乙醇的产能产量在于2006年超越巴西后成为了生物乙醇第一生产国^[3]。继巴西和美国之后，欧盟中的部分国家（如法国、西班牙和瑞典等）也开始推动燃料乙醇的生产和使用，采用的原料大比例为小麦，其他成员国如荷兰、德国等也陆续提出相关规划。

1.2.2 燃料乙醇在国内的发展概况

消耗陈化粮，解决农民卖粮难的问题是我国开发燃料乙醇的初衷，发展初期参照着巴西和美国的方法，即采取政府扶持的办法降低企业高成本的乙醇生产费用，在解决陈粮堆积严峻问题的同时又发展了清洁能源。在“十一五”期间政府叫停并开始核准相关燃料乙醇项目，提出发展燃料乙醇不能与粮争地，与人争粮的目标，从而开启 “十二五”期间的鼓励以非粮作物为原料发展生物乙醇的方向，采用木薯等非粮作物进行淀粉发酵。最近我国能源局发布的多项试点方案与细则中都提到乙醇汽油的重要性，扩大了燃料乙醇的市场需求量，进一步刺激了企业与科研人员的研发激情，推动了燃料乙醇生产技术的快速改革。

1.3 乙醇制备方法概况

1.3.1 化学合成法制取乙醇

现阶段主要的乙醇生产方法有以石油气为原料的乙烯水合法（包括直接水合和间接水合），乙醛加氢法和以合成气（一碳气体及氢气）为原料的羰基合成法。采用来源于石油的乙烯作为原料合成乙醇不仅需要高昂的设备费用，原料费用也是限制该方法扩大化使用的一大因素。相较于乙烯水合而言，乙醛加氢的步骤更为的复杂且昂贵，首先要将乙烯氧化制取乙醛的前置条件便扼杀了其发展的可能性。最可能实现也是适用性最大的就是将合成气催化合成乙醇，即费托合成法（FT）^[4]。费托合成法的主要工艺过程包括原料气的制备与净化、合成气压缩、催化合成和乙醇精馏四个步骤。FT法的相对优点在于产量高、成本低和基建费用少，但是FT合成法的主要缺点也是所有化学催化合成的缺点在于其催化条件的苛刻和催化剂的价格与污染问题^[5]，严苛的条件加上昂贵的催化剂使得FT合成法并不能完全商业化。

1.3.2 生物发酵法制取乙醇

利用微生物发酵生产乙醇在很久远的年代已经出现，酒曲酿酒就是对微生物发酵产乙醇最好的实证。现如今，不仅仅是利用酿酒酵母发酵粮食来生产乙醇，为了追求更高效、更廉价的乙醇生产方式，遍寻发酵原材料和发酵菌株，在实践与实验中对生产技术不断革新，发展出了多元化的生产路线。转化技术处于研发、中试或示范阶段的生物液体燃料被定义为先进生物液体燃料，现阶段生物发酵生产的燃料乙醇主要是第二代或第三代生物液体燃料^[6]。

发酵路线按原材料不同可以简单的将生物发酵产乙醇分为粮食与非粮农作物发酵、纤维素发酵和气发酵三种。

（1）粮食与非粮作物发酵

以粮食与非粮作物为原材料进行发酵分为以玉米、小麦等为原料的淀粉类发酵技术和以甘蔗等含糖量高作物为原料的糖蜜类发酵技术。一般认为以主粮为原料的燃料乙醇被称为第一代，而利用木薯等非粮作物为原料生产的燃料乙醇被称为1.5代燃料乙醇。以玉米为例，其传统处理方法包括湿法碾磨和干法粉碎两种，湿法碾磨的处理较为简单，直接将玉米浸泡于含二氧化硫的水中等待组分分离后淀粉直接发酵转化为乙醇，而干法粉碎法则占据了美国70%的乙醇生产份额^[7]，精细碾磨过的玉米粉蒸煮后直接发酵转化，然后进行下游处理收集乙醇。对比淀粉类发酵方法，以甘蔗为原料的糖蜜类发酵方法更加简单，甘蔗经简单处理（切断、压榨及过滤）后获得含糖量高的溶液，可以直接作为培养基进行生物发酵。糖蜜发酵的糖醇转化率一般高于95%，远高于淀粉发酵，也是目前技术最简单、最适合大规模推广的生产工艺。

（2）纤维素发酵

不占用社会资源的纤维素乙醇发酵技术是现阶段最令人关注的，纤维素乙醇也被称为第2代燃料乙醇^[8]。纤维素制备乙醇的方法在发展中演化出不同的技术工艺，其中的代表便是纤维素解聚-糖发酵^[9,10]与纤维素气化-合成气发酵两大类。纤维素先解聚成小分子糖，其操作作技术包括蒸汽爆炸、氨纤维膨胀(AFEX)、挤压、离子液体萃取、稀酸和酶水解^[11]，再经过微生物的发酵转化为乙醇^[12]，还可以直接使用微生物将纤维素转化为乙醇^[13]，其二者本质还是糖发酵机制。相比于气化发酵而言，纤维素解聚-糖发酵技术适合于现阶段已有产业的过渡发展，如Poet-DSM、Quad County Corn等公司在美国政府的扶持下在原有的玉米乙醇设施基础上大力开展纤维乙醇的研发与规模化^[14]。直接气化纤维素获得合成气用以生物发酵也是一个值得探索的方向，纤维素气化后产生的一氧化碳、二氧化碳、少量的氢气与甲烷、水蒸气以及其他含量极低的杂质气体经处理后直接通入发酵罐中作为原料进行生物发酵或得乙醇^[15]，气体发酵的技术可行性已经被新西兰的郎泽公司(Lanza Tech)及美国的CosKata公司所验证，均已建成了相关的中试装置。

（3）气体发酵

利用富含一碳气体和氢气的合成气为原料经微生物的代谢途径转化为乙醇是现如今对燃料乙醇生产技术的前沿研究方向。合成气来源广泛且处理方便使得其广受关注，缺氧气化煤或生物质即可得到高含量的一氧化碳和二氧化碳气体，相比较其他生物发酵的前处理而言，合成气发酵在温和的温度和压力下进行，避免使用昂贵的预处理工艺和酶^[16]，简单的燃烧气化节省了大量的人力物力财力。除此之外，值得一提的是原料进入气化炉后经燃烧而分解形成多种小分子产物^[17]，可以最大限度的利用原材料中的生物组分，获得更高的乙醇产量。合成气可以有多种来源，例如煤、石油、天然气和泥炭煤的气化、某些工业废气流、固体废物气化和固体生物质热解/气化。只有来自固体生物质的合成气可以被视为“绿色碳”。如果化石来源或由化石来源制成的产品被用来产生合成气，它必须被认为是“黑碳”^[18]。然而化石能源经过长时间的发展，现如今的气化合成气大部分是来源于成熟的化石能源，如煤制合成气发酵^[19]。大力发展气体发酵的目的除了生成燃料乙醇缓解能源危机之外还让人看到了其在环境保护方面的作用。合成气的主要底物成分是一碳气体（一氧化碳和二氧化碳）和氢气，而很多工业废气中富含这些组分，如何高效利用如此大量且集中的原材料进行转化是研究的重点和突破点。

生物质气化发酵厌氧产乙醇的技术路线可以分为上游和下游，上游是原料气化获得合成气过程，下游是合成气经微生物厌氧发酵产乙醇与乙醇提取的过程。因为其发酵过程中一般使用的菌群为严格厌氧菌，所以在气化过程中一般会采取缺氧燃烧的方法确保有足够的一氧化碳气体的产生和尽可能减少氧气的掺入对厌氧发酵的影响。在通过人工燃烧生物质获取合成气的途径之外，利用工业废气进行气发酵生产化学品^[20]成本更加低廉，在合成高价值商品的同时还减轻了环境污染^[21]。

1.3.3 合成气厌氧发酵菌株概述

现阶段所发现可利用一碳气体（一氧化碳、二氧化碳）和氢气进行生物发酵的菌株，主要为一些厌氧梭菌，它们利用还原性乙酰辅酶A途径固定一氧化碳和/或二氧化碳，以合成气作为碳和能源生产生物燃料，如乙醇、丁醇或己醇，以及高价值化学品，如乙酸盐、乳酸盐、丁酸盐、己酸盐、2，3丁二醇和丙酮等。乙酰酶原存在于20多个不同的属和100多个不同的物种中^[22]，这一类厌氧微生物均为革兰氏阳性菌，菌体形态主要包括球菌、短杆菌、杆菌和链状菌等。

合成气发酵合成乙醇所使用的最主要和最广泛的菌株就是Clostridium ljungdahlii^[23]，除此之外还有同为该梭菌属的Clostridium ragsdalei和Clostridium autoethanogenum等。在纯菌株发酵之外，还有少数研究人员在进行着多菌株的混合培养以期望获得更高的乙醇产量和更低的乙酸含量，如Kan Liu等人利用Alkalibaculum bacchi strain CP15和Clostridium propionicum^[24]、王风芹等人利用菌株LP-fm4、Clostridium sp.P11和A-fm4^[25]和本实验室也曾利用Clostridium ljungdahlii、Clostridium ragsdalei和Clostridium autoethanogenum对多菌混合培养体系下合成气发酵生产燃料乙醇的潜力进行探索。

1.3.4 合成气转化乙醇的代谢途径

微生物利用合成气为原料产乙醇的重要代谢途径是通过Wood-Ljungdahl途径（WLP），WLP被认为是最古老的二氧化碳固定途径^[26]，在其他文献中已经得到了广泛的注释^[27.28]，因此这里仅给出涉及本文的简略概述（图1.1）。

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