目的：学习掌握基于CRISPR-Cas技术的基因敲除方法;

验证PRNP基因失活后对肿瘤细胞的影响。

研究现状：CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中,是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。CRISPR-Cas9技术通过gRNA特异性识别含有PAM的靶DNA序列,Cas9蛋白对靶序列进行切割,然后通过细胞DNA修复机制进行修复从而实现基因组的高效编辑。CRISPR-Cas9系统广泛应用于基因治疗、基因功能研究、建立与人类疾病相关的动物模型。CRISPR-Cas9是目前最高效的基因组编辑系统，它基因编辑效率高、构建方法简单、可实现多基因打靶、成本偏低。

　朊蛋白类疾病,也叫传染性海绵状脑病,是一类致命的传染性中枢神经系统退行性疾病。主要包括:发生在绵羊和山羊上的羊搔痒病,发生在牛上的牛海绵状脑病(即疯牛病),以及发生在人上的克雅氏病(CJD)、GSS综合症、致死性家族失眠症(FFI)等。已有实验证明缺失PrP的小鼠不仅能够正常发育和繁殖后代并且具有抵抗传染性海绵状脑病的能力。PRNP基因敲除的大型动物也已有实验证明能表现出正常的个体发育和行为能力。

2. 研究的基本内容与方案

研究基本内容及目标：

应用CRISPR-Cas技术敲除黑色素瘤细胞MM-MC中PRNP基因。

学习并设计CRIPSR-Cas方法，设计引物，转染癌细胞，筛选单克隆，验证PrP基因的敲除。

验证PRNP基因失活后对肿瘤细胞的影响。

拟采用的技术方案及措施：

①lip 2000转染，gRNA和cas9共转(各1.5μg)，6孔板80％～90％细胞，5h后换液