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毕业论文网 > 开题报告 > 化学化工与生命科学类 > 生物技术 > 正文

乳腺微环境对乳腺发育的影响开题报告

 2020-02-10 22:35:32  

1. 研究目的与意义(文献综述)

细胞微环境(cellmicroenvironment)是细胞赖以生存的复杂环境。由多种支持细胞及结缔组织组成的基质(stroma),是构成上皮细胞微环境的主要成分,对上皮细胞的命运决定及形态发生具有一定的决定性作用。

乳腺基质由细胞外基质(extracellular matrix, ecm)和基质细胞构成。ecm 包括蛋白多糖,透明质酸,胶原,纤维粘连蛋白,层粘连蛋白等纤维蛋白,生长因子,趋化因子,细胞因子,抗体及代谢产物等。基质细胞主要包括成纤维细胞及脂肪细胞等支持细胞,血细胞以及免疫细胞。

乳腺成纤维细胞是构成乳腺上皮细胞微环境的重要成员,作为基质功能的主要行使者,调控乳腺上皮分支形态的发生。一方面,成纤维细胞分泌fgf(fibroblast growth factor)、igf(insulin-likegrowth factor)等多种生长因子,这些生长因子结合于上皮细胞上相应的受体,直接影响上皮细胞存活、增殖、迁移等多种行为,促进上皮分枝状形态发生。另一方面,成纤维细胞通过调控细胞外基质的重构(ecm remodeling)间接影响上皮细胞的功能。作为调控乳腺细胞外基质的管家,成纤维细胞可以分泌胶原,蛋白多糖,纤维连接蛋白等多种细胞外基质的成分。同时,成纤维细胞还可以合成基质金属蛋白酶(metalloproteinases , mmps)等蛋白酶,降解细胞外基质。通过调控基质的重构,不仅可以控制储存于细胞外质中的生长因子以及细胞因子的释放,还可以通过基质硬度的改变影响上皮细胞行为。因此,对于成纤维细胞的功能研究是阐明基质功能的重要方面。

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2. 研究的基本内容与方案

(一)基本内容及目标

1、验证乳腺基质中成纤维细胞存在FGFR受体及主要作用类型

2、探究基质中FGF信号通路在乳腺发育不同时期的影响

3、基质中FGFR1、FGFR2基因敲除、过表达小鼠的表型分析

(二)技术方案

1、验证乳腺基质中成纤维细胞存在FGFR受体

(1)从野生型小鼠中分离出乳腺成纤维细胞,种植于基质胶中,进行体外培养。

(2)实验组用FGF2刺激,对照组不加FGF2,培养3天,。

(3)观察纤维细胞迁移情况。

2、乳腺成纤维细胞中FGFR的表达分析

(1)从野生型小鼠中分离出乳腺成纤维细胞。

(2)提取细胞内总RNA并进行纯度分析,反转录成cDNA。

(3)设计相关引物,利用qPCR技术检测细胞中FGFR1,FGFR2,FGFR3,FGFR4表达情况

3、基质中FGFR1、FGFR2基因缺失对乳腺发育的影响

(1)体外模型——FGFR缺失对乳腺成纤维细胞的影响

①分离培养FGFR1 fl/fl、FGFR2 fl/fl、FGFR1,2 fl/fl小鼠的乳腺成纤维细胞,体外培养

②利用Cre-Loxp技术构建出FGFR1 KO,FGFR2 KO,FGFR1,2KO质粒载体

③腺病毒转染后,利用流式细胞仪和western blot技术分别筛选出FGFR1敲除、FGFR2敲除、FGFR1和FGFR2同时敲除的成纤维细胞,种植于基质胶中。

④FGF2刺激,培养3天,观察细胞迁移情况。

(2)小鼠模型——FGFR缺失的表型分析

①利用Fsp-Cre的小鼠与目的基因小鼠杂交,得到FGFR1 KO,FGFR2 KO,FGFR1,2KO的小鼠。

②分别于小鼠出生后3周、5周、10周及怀孕期取乳腺进行Carmine 染色。

③观察乳腺导管延伸度、分支节点数及TEB数量,记录乳腺发育情况。

4、基质中FGFR1、FGFR2基因过表达对乳腺发育的影响

(1)体外模型——FGFR过表达对乳腺发育的影响

①分离培养FGFR1 fl/fl小鼠的乳腺成纤维细胞,体外培养

②利用CRISPER-CAS 9技术构建出FGFR1 过表达,FGFR2 过表达,FGFR1,2 过表达的质粒。

③腺病毒转染,利用流式细胞仪和western blot技术分别筛选出FGFR1过表达、FGFR2过表达、FGFR1和FGFR2同时过表达的成纤维细胞,种植于基质胶中。

④FGF2刺激,培养3天,观察细胞迁移情况。

(2)小鼠模型——FGFR过表达的表型分析

①利用CRISPER-CAS9技术得到FGFR1过表达、FGFR2过表达、FGFR1和FGFR2同时过表达的小鼠。

②分别于小鼠出生后3周、5周、10周及怀孕期取乳腺进行Carmine 染色。

③观察乳腺导管延伸度、分支节点数及TEB数量,记录乳腺发育情况

(三)主要实验方法:

1、RNA提取、纯度分析、逆转录

提取总RNA

细胞内总RNA利用试剂盒进行提取。提取步骤如下:

(1)终止培养后,吸出培养板孔内的培养液,使用PBS冲洗3次。

(2)向每孔中加入350 μl RLT lysis buffer提取试剂孵育10-15 mins,并轻轻摇晃培养板,使细胞和试剂充肥触。

(3)收集细胞并转移至离心管中,14000×g 离心 30 s。

(4)转移上清液于另一离心管中,加入等体积乙醇,轻轻颠倒,转移至RNeasy mini spin column,14000×g离心30 s。

(5)弃去管中液体,向离心柱表面加入RW1 700 μl 14000×g 离心 30 s清洗柱子,然后加入RPE 500 μl 14000×g 离心 30 s清洗柱子。

(6)14000×g 离心,空转柱子30 s。

(7)加入20 μl 无RNA酶的水于柱子膜中央,静置1 min后,14000×g 离心1min溶解RNA。

分析RNA纯度

取溶解的RNA稀释10倍,使用分光光度计测量波长为260 nm和280 nm时的吸光度,观察RNA纯度是否合格,并测得RNA浓度。所提取的RNA可保存于-80℃冰箱。

逆转录

使用takara试剂盒将RNA逆转录为cDNA,反应体系(20ul体系)如下:

试剂名称 体积
5XMastermix
4ul
mRNA
1ul
Nuclease-freewater
to 20 ul

设置PCR仪的反应条件为:85℃孵育15 mins,4℃终止反应。逆转录产物-80℃保存。

2、实时荧光定量PCR(Quantitative real-time –PCR,qPCR)

设计相关引物,进行扩增,反应体系(10ul)如下:

实验试剂 体积

FastSYBRGreen Master Mi(2×)

5ul
正向引物 0.5ul(5mM)
反向引物 0.5ul(5mM)
模板DNA 1ul
去核酸酶水 3ul

将上述试剂按顺序加入96孔板中,小心混匀后离心。使用实时荧光定量PCR仪对DNA进行扩增。扩增条件如下:

步骤 温度 时间 循环数
预变性 95℃ 15min 1
变性 94℃ 15s 4
退火 60℃ 20s 4
延伸 72℃ 30s 4

计算目的基因表达量

3、体外细胞培养

(1) 原代乳腺上皮类器官(organoid)的分离培养

分离:原代乳腺上皮类器官取自8-10周母鼠。取小鼠乳腺3#,4#和5#,机械切碎。在新鲜消化液(0.2% collagenase 和 0.2% trypsin)中消化30分钟. 450g离心10分钟。离心后取下层沉淀,加入DNase I消化5分钟内. 然后进行差速 (短暂上升至 450 × g). 收集下层沉淀,即为上皮类器官。

培养:提取的上皮类器官可种植于Matrigel,加入培养基(DMEM/F12 , 10 μg/mL insulin,5.5 μg/mL transferrin, 6.7 ng/mL selenium, 100 U/ mL penicillin, 和100 μg/mL streptomycin。

#61656;(2) 成纤维细胞的分离培养

分离:上清离心后细胞沉淀种植于细培养板上

培养:加入成纤维细培养基 (DMEM ,10% (vol/vol) FBS (Sigma), 10 μg/ mL insulin, 5.5 μg/mL transferrin,6.7 ng/mL selenium, 100 U/mL penicillin, 和100 μg/mLstreptomycin])。30分钟后,换新的培养基,成纤维细胞即已经贴壁。成纤维细胞种植于低吸附版中过夜,即形成成纤维细胞球(fibrospheres)。

4、乳腺细胞染色

#61656; Carmine 染色:取4号乳腺平铺与粘附载玻片上。加入Carnoy’s solution (100% ethanol : glacial acetic acid=3:1)中4 °C固定过夜, 75% ethanol 和流水冲洗后,在alum Carmine中染色4小时。 酒精脱水后至于二甲苯中,长期保存可至于水杨酸甲酯中,体视显微镜拍照。 Ductal length是指淋巴结中心至上皮分支最远端的距离。Branch number 指淋巴结外侧单位长度导管上分支的数量。TEB的数量是指整个4号乳腺上TEB的数量。ImageJ 进行数据分析。

#61656; Masson 染色:乳腺与 4%多聚甲醛中固定过夜,石蜡包埋,以5 um的厚度进行切片。应用试剂盒进行Masson染色。

#61656; HE 染色:石蜡切片后应用HE染色试剂盒进行染色。

5、Western blot技术

#61656; 按1×107细胞数量加入200 μl 细胞蛋白裂解液并加入蛋白酶抑制剂混合物裂解细胞,用枪头吸打,冰浴30mins。充分裂解后将含有细胞的裂解液吸入预冷的1.5 ml离心管中,4℃ 14000 rpm/min离心15 mins;收集上清液分装后–80℃保存,用于后续试验。

#61656; 上样和电泳:取20 μl蛋白样品-牛血清白蛋白BSA,加入蛋白裂解液调整为相同浓度的蛋白样品,加入6×SDS上样缓冲液混匀,99℃变性5mins。按上表顺序依次将试剂依次加入离心管中,振荡混合均匀后, 按顺序加入预制胶中,将凝胶放入电泳槽中,倒入电泳缓冲液中,恒压140V,电泳。

#61656; 转膜:聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜在甲醇中浸泡10 s至全部浸湿。取出电泳后的SDS-PAGE凝胶,将滤纸、聚偏氟乙稀PVDF膜和SDS-PAGE凝胶置于转膜缓冲液中浸泡5 mins。25 V 电压转膜1 h。

#61656; 抗体孵育

(1)将转膜后的PVDF膜取出,使用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液(Tris-

bufferedsaline containing 0.05% Tween-20, TBST)室温封闭1 h。

(2)将PVDF膜置入5%脱脂奶粉TBST缓冲液稀释的一抗4℃孵育过夜。

(3)室温恢复30 mins,TBST缓冲液冲洗3次,每次5 mins。

(4)辣根过氧化酶(horse radish peroxidase, HRP)标记的二抗室温孵育1 h。

(5)TBST缓冲液冲洗3次,每次5 mins。

#61656; 显色及图像分析

向冲洗过的PVDF膜上滴加新配置的增强型化学发光液(enhanced chemiluminescent, ECL),避光孵育5 mins,并进行曝光。对获得的条带使用Image J软件进行分析。


3. 研究计划与安排

第1周:了解论文题目,认识所需完成的主要内容和任务;搜集相关学术期刊、论文、文稿、专利、教材等资料,阅读后进行总结,对论题形成一个初步的系统性的认识。利用生物信息技术,对研究前沿进行分类整理和总结。

第2周:完成毕业论文开题报告,确定实验技术路线,确定具体的实验方案和步骤。

第3周:建立fgfr基因敲除/过表达的体外模型及小鼠模型,体外培养乳腺成纤维细胞

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4. 参考文献(12篇以上)

【1】 pond ac, bin x, batts t,roarty k, hilsenbeck s, rosen jm. fibroblast growth factor receptor signalingis essential for normal mammary gland development and stem cell function. stemcells. 2013;31(1):178-89.

【2】gong sg. isoforms of receptors of fibroblast growth factors. j cellphysiol. 2014;229(12):1887-95.

【3】babaei b, davarian a, lee sl, pryse km, mcconnaughey wb, elson el,et al. remodeling by fibroblasts alters the rate-dependent mechanical propertiesof collagen. acta biomater. 2016;37:28-37.

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