摘 要

随着铜矿开采和饲料中铜元素过度添加，我国水体面临严重的铜（Cu）污染问题。产脲酶微生物分泌的脲酶，可专一性的将尿素水解为碳酸根离子和铵根离子，同时提高环境的pH。土壤和水体中的铜离子，在产脲酶微生物生长代谢的碱性条件下可与碳酸根离子反应，以碳酸盐沉淀的形式固定下来。

本课题主要优化了产脲酶菌的生长条件，探究了产脲酶菌株分解尿素的性能和对水溶液中铜离子碳酸盐成矿的影响因素，结果表明：葡萄糖和磷酸二氢钾是本实验产脲酶菌株生在的最佳碳源、磷源，其生在的最佳pH为8.5左右，温度为35℃左右，在最佳产脲酶菌生长条件下能将尿素含量从2g/L降低到0.094g/L降解率达95.3%。随着pH值增大，菌株对溶液中铜离子矿化能力先增强后下降；25-35℃为菌株的最适生长范围，菌株的生长良好，脲酶的催化活性也随温度的上升而增强，细菌对铜离子的固化去除率在35℃达到最高。

在pH为8.5，温度为35℃，在铜离子浓度为0.05-0.1g/L的范围内，产脲酶菌株对溶液中铜离子的普遍去除率都超过80%，最高达到了95.9%。具有良好的除铜能力，同时经过矿化产物耐酸性实验表明，产脲酶菌矿化产物的耐酸性pH在3左右。因此该菌株能在低铜离子废水中发挥作用，应用前景良好。

关键词：微生物诱导碳酸盐成矿；产脲酶菌；Cu

Abstract

With the excessive addition of copper elements in copper mining and feed, China's water bodies are facing serious problems of copper (Cu) pollution. Urease produced by urease-producing microorganisms can specifically hydrolyze urea to carbonate and ammonium ions while increasing the pH of the environment. The copper ions in soil and water can react with carbonate ions under the alkaline conditions of urease-producing microorganisms' metabolism and are fixed in the form of carbonate precipitation.

This project mainly optimized the growth conditions of urea-producing bacteria, explored the properties of urease-producing strains to decompose urea and the influencing factors on copper ion carbonate mineralization in aqueous solution. The results showed that glucose and potassium dihydrogen phosphate were the urease producing enzymes in this experiment. The best source of carbon and phosphorus for the strains was born. The optimum pH was about 8.5, the temperature was about 35°C, and the urea content could be reduced from 2g/L to 0.094g under the conditions of the best urease production. The degradation rate of /L reached 95.3%. With the increase of pH value, the strain's copper ion mineralization ability in the solution first increased and then decreased; 25-35°C was the optimum growth range of the strain, the strain grew well, and the catalytic activity of urease also increased with increasing temperature. Bacteria to copper ion cure removal rate reached the highest at 35 °C. The acid resistance test of the mineralized product showed that the pH value of the urea-producing mineralized product was around 3.

At a pH of 8.5, a temperature of 35°C, and a copper ion concentration in the range of 0.05-0.1 g/L, the urease-producing strains generally have a copper removal rate of more than 80% and a maximum of 95.9%. With good copper removal ability, the strain can play a certain role in low-copper ion-containing wastewater and has a good application prospect.

Key words: Microbially induced calcite precipitation; Urease-producing bacteria; Cu

目 录

摘 要 I

Abstract II

第1章 绪论 1

1.1 我国水体重金属污染现状 1

1.2 铜污染的危害 1

1.3 传统水体铜污染治理进展 2

1.4 产脲酶微生物治理铜污染的研究进展 2

1.5研究的意义和主要内容 3

1.5.1 研究的目的及意义 3

1.5.2 研究课题的主要内容 3

第2章 产脲酶菌株的筛选、纯化 5

2.1实验材料及仪器 5

2.1.1 菌源选取 5

2.1.2 实验仪器及试剂 5

2.2实验方法 6

2.2.1 培养基配方及实验试剂 6

2.2.2 产脲酶菌株的筛选、分离与保存 6

2.2.3 产脲酶菌株的培养和生长曲线测定 6

2.3 产脲酶菌株的最佳生长条件优化 6

2.3.1 菌株生长条件优化实验 6

2.4 实验结果及讨论 8

2.4.1 产脲酶菌的筛选、纯化与产脲酶能力检测 8

2.4.2 菌株的生长曲线 9

2.4.3 菌株UR-2的最佳生长条件优化 10

2.5 本章小结 15

第3章 产脲酶菌株对水溶液中铜离子碳酸盐成矿影响因素探究 16

3.1实验材料与仪器 16

3.1.1 菌株培养基 16

3.1.2 实验仪器及药品 16

3.2实验方法 17

3.2.1 细菌对铜离子的矿化实验 17

3.2.2 探究不同因素对产脲酶菌株固化溶液中铜离子能力的影响 17

3.3 产脲酶菌株矿化铜离子产物的耐酸性测试 18

3.4 实验结果及讨论 18

3.4.1 菌株矿化能力检测 18

3.4.2 菌株对溶液中铜离子固化能力的研究 19

3.4.3 矿化产物的耐酸性分析 22

3.5 本章小结 22

第4章 结论与展望 23

4.1 实验结论 23

4.2对产脲酶菌株在处理含铜废水的展望 23

致 谢 24

参考文献 25

第1章 绪论

1.1 我国水体重金属污染现状

由于现代工业的发展，煤、矿物油的燃烧、固体的废弃物的堆置以及生活废水等导致大量重金属进入河流。Cu、Cd、Cr、Hg等均是能够对水体产生污染的重金属，通常情况下，对于极微量的重金属不会产生毒害作用，但是一旦这些重金属超过一定的浓度标准，便会引起水体污染^[1]。重金属超标的水体具有很大毒性，不仅会毒害水中的水生生物，还会直接或间接地威胁毒害人类的生体健康。

1983年，中国首次发生严重的水体重金属污染以来，随着经济的发展，大量工业企业的建设，排放的重金属量越来越大，水体的污染也愈加严重。目前，我国各大江河湖库普遍受到不同程度的重金属污染，其底质的污染率高达80.1%^[2]，而且已经开始影响到水体的质量。通过研究矿区地表水、不同地区的江河湖海库等水体中重金属含量及其变化，得到以下结论：（1）受水环境条件影响，重金属主要富集于悬浮物及沉积物中^[3]。一般悬浮颗粒物中重金属含量比沉积物中高几倍，是水体溶解态重金属的几百倍^[4]。水体中重金属污染物的含量很低，市区河段重金属污染普遍高于非市区河段^[5]。（2）湖泊支流中的重金属污染物的含量普遍高于湖区，河口污染较严重^[6]。（3）水体中重金属含量与pH值有关，碱性条件伊沉淀于底泥，酸性条件易释放到水体中。（4）长江口水体中重金属的含量，枯水期大于洪水期，底层大于表层，而且各种重金属污染物相关性较好，说明其来源相同^[7]。（5）表层海水中重金属污染物含量比临近海湾海水中低，且高于外海，重金属污染物分布：近岸海区大于中部地区^[8]。（6）海水中重金属污染物分布受径流、大气干湿沉降、pH、盐度和自身性质等复合因素控制且在局部海域，某个因素会起主要作用^[9]。

1.2 铜污染的危害

铜对植物、动物以及微生物都有毒害作用。大部分植物对于铜离子具有一定的敏感性，如果吸收过量的铜离子便会给植物生理化过程造成很多危害。过量的铜在土壤中会毒害植物细胞，改变植物光合作用，呼吸作用、酶活性、DNA和膜的完整性，使其失去原有的结构和功能。动物摄入铜离子浓度过高时会患上某些疾病。导致肝脏和肾脏受到损害，持久性摄入过量铜离子甚至会导致肝硬化。土壤或沉积物中铜离子含量过高时会使真菌生物量减少，也会降低细菌的新陈代谢功能，抑制其对葡萄糖的吸收和矿化作用。铜离子在微生物代谢过程中与核酸、酶、蛋白质发生相互作用影响其细胞壁、细胞膜、细胞内部的作用。

1.3 传统水体铜污染治理进展

由于水体中铜离子的迁移能力有了很大提高，水体中铜污染治理变得相对容易，化学沉淀、絮凝技术和吸附法均能达到比较好的治理效果^[10]。离子交换法、膜分离及微生物法等技术对铜离子含量较低的水体也能达到很好的治理效果^[11]。

化学沉淀法、化学絮凝法和吸附法是目前比较传统和成熟的技术，在发生突发性重属泄露事故时，通常会采用这几种方法作为应急处理手段^[12]，但是这几种方法往往有着材料成本高和容易产生二次污染的问题。化学沉淀法通常通过投加生石灰、烧碱等碱性物质的方式，控制水体碱性条件，使铜离子以碱式碳酸铜、氢氧化铜等形式从水体中分离出来^[13]；絮凝法则通过投加絮凝剂使铜离子从水体中分离出来，絮凝剂多为金属盐、微生物胞外分泌物和高分子材料^[14]；吸附法通过活性炭等多孔固态物质吸附水中的铜离子^[15]。

阳离子交换树脂可以比较有效的处理高溶度铜污染水体，螯合树脂和两性树脂对低浓度铜离子有较好的吸附效果^[16]，但它们的选择性较差，无法大规模应用。膜分离技术可以高效过滤分离溶液中的铜离子，但膜材料存在易堵塞、处理量较少的问题。

目前，水体重金属污染处理领域的研究团体对现有的传统方法进行了很大的改进，如研发新的絮凝剂及吸附材料等，但是其成本高、工艺复杂和易产生二次污染等缺点仍难以克服。

1.4 产脲酶微生物治理铜污染的研究进展

微生物技术处理水体污染具有无二次污染、处理成本低等特点^[17]，但是微生物的生长繁殖过程对环境的要求较高，高浓度的铜离子会使微生物中毒，因此在铜离子含量较高的污染水体中一般不能采用微生物处理法。而在较低浓度的铜离子治理中，微生物处理技术正逐步显现其优势和作用。

目前微生物技术治理水体铜污染，主要以藻类、细菌以及真菌作为研究对象^[18]，主要可以分为微生物胞外沉淀及微生物吸附两大类^[19]。微生物对铜离子的胞外沉淀作用主要依靠微生物的代谢产物，主要有胞外分泌物（如多糖、糖蛋白等）和阴离子（氢氧根、碳酸根、磷酸根等）两类，代谢产物与游离态铜离子反应生成稳定存在的络合物或沉淀，使铜离子无法被植物及鱼类吸收。胞外分泌物大多数为多孔结构，其表面通常含有比较丰富的-SH、-COOH、-OH等基团，可以高效络合游离的铜离子。微生物吸附法利用微生物表面的电荷及有机基团可以有效吸附铜离子，铜离子也能作为细胞代谢所需要的元素，通过主动运输的方式被微生物吸收。

近年来，微生物诱导碳酸盐成矿（MICP，Microbially induced calcite precipitation）技术成为土壤和水体重金属污染治理领域的研究热点。MICP的基本原理是利用微生物的代谢，提高环境中碳酸根离子含量，从而使重金属离子形成碳酸盐沉淀。

产脲酶菌株可将尿素水解为碳酸根离子和铵根离子，从而使环境pH值升高，并使碳酸钙离子和钙离子形成碳酸盐晶体，其细胞表面又能吸附金属阳离子，使微生物细胞成为晶核，最终形成碳酸盐沉淀。

尿素酰胺水解酶简称脲酶，英文名Urease，是人类首次发现的以金属镍离子为催化中心的金属酶^[20]。脲酶可以专一的水解尿素，该反应的速率是自然条件下尿素水解速率的10¹⁴倍^[21]。产脲酶微生物一般为好氧菌，在其MICP过程中，铜离子可与碳酸根离子形成碳酸盐沉淀，以共沉淀的形式掺杂在CuCO₃沉淀内部或沉积在CuCO₃表面。

产脲酶菌株诱导铜离子矿化的影响因素有很多，目前已有研究的影响因素主要有pH、温度、铜离子浓度等。不同pH条件下，产脲酶菌株的生长情况不同，与重金属离子形成产物的粒径分布和稳定性也有差异。温度是影响产脲酶微生物生长情况的重要因素，脲酶的催化能力受温度的影响也很大，因而温度也是影响产脲酶微生物固化铜离子能力的重要因素。铜离子浓度对产脲酶菌株的生长有一定的毒害作用。

1.5研究的意义和主要内容

1.5.1 研究的目的及意义

随着我国经济的高速发展，重金属污染问题也变得越来越严峻。我国铜污染的现状十分严峻、铜污染的治理刻不容缓。找到一种方便、低成本并且无副作用的治理方法，已经成为目前环保工作者研究的首要目标。传统治理方法如工程法、物理化学法都存在着成本高、容易造成热二次污染、无法保持水体原始结构等问题，而用植物修复又存在着周期性长，适应不同水体能力差等问题。产脲酶菌诱导碳酸盐沉淀的方法，能有效固化水体中的铜离子，并且该方法成本低廉，对低浓度铜污染水体和土壤的修复效果较好同时，产脲酶菌可以广泛适应我国不同地区的水体。

本论文以筛选所得的产脲酶菌株为研究对象，目的是寻找该产脲酶菌株生物诱导碳酸盐沉淀过程中游离态铜离子的固化情况，探究在不同pH条件下、不同温度条件下及不同铜离子浓度梯度环境下产脲菌株的活性及成矿能力。本研究旨在探究产脲酶菌株处理铜离子污染水体的应用及其性能研究。

1.5.2 研究课题的主要内容

本论文主要研究内容包括以下几个方面：

（1）使用高浓度尿素溶液从土壤中富集筛选出产脲酶菌株菌液，从中分离、纯化得到高效产脲酶菌株；

（2）改变产脲酶菌株的生长条件，研究不同碳源、氮源、温度、pH等条件下该菌株的产脲酶特性，通过单因素分析和正交实验，优化得到筛选所得产脲酶菌的最佳产脲酶条件；

（3）研究产脲酶菌株修复铜污染水体性能，模拟不同温度、pH条件和Cu² 离子浓度，考察该产脲酶菌在不同条件下诱导溶液中Cu² 离子碳酸盐成矿的能力。

第2章 产脲酶菌株的筛选、纯化

诱导Cu² 离子形成碳酸盐沉淀的核心，是产脲酶微生物的MICP过程。因此，筛选出具有高耐铜能力的产脲酶菌株是本课题的基础。目前研究发现的产脲酶能力较强的好氧细菌，有巴氏芽孢八叠球菌、芽孢杆菌等细菌，其中产脲酶能力最强的细菌为巴氏芽孢八叠球菌，该菌细胞内合成的脲酶可达细胞干重的1 %。徐晶等^[22]研究结果显示，巴氏芽孢八叠球菌分泌脲酶能力很强，培养60 h后其对尿素的水解率达93.2 %。Bachmeier等^[23]筛选的巴氏芽孢八叠球菌在培养72 h后，脲酶活性达到1.57 Mm·min^-1·mg^-1，对尿素的水解率达90 %以上。Tang等^[24]筛选的球形芽孢杆菌培养48 后，溶液中NH₄ 离子含量为9.42 mg/L，尿素的水解率达87 %。李萌等^[25]从土壤中分离出的巨大芽孢杆菌，培养48 h后，脲酶活性达20 U/ml以上，对尿素的水解能力也很强。目前产脲酶菌株的选育方法，有化学诱变、物理诱变、基因工程和NH-YE培养基选育等方法。化学和物理诱变的优秀菌株产率较低，基因工程和NH₄-YE培养基选育的工作量较大，无法同时保证脲酶的高产量和菌株高耐铜能力。本研究在此类研究筛选产脲酶菌株方法的基础上，提出了从模拟铜污染土壤中筛选产脲酶微生物的方法，保证了筛选菌株对高浓度铜污染的耐受能力和高脲酶产量。

本章以湖北省武汉市的红棕壤，制备了模拟铜污染土壤，从中筛选出了一株高效产脲酶菌株，对其生理生化属性进行了鉴定，并对其产脲酶活性和水解尿素能力进行了研究，同时使用单因素分析和正交实验对其生长的最优条件进行了探究，为下一步诱导Cu² 离子碳酸盐成矿的研究奠定基础。

2.1实验材料及仪器

2.1.1 菌源选取

选取湖北省武汉市洪山区武汉理工大学某花园的红棕壤，去除表层5 cm附近土壤，从5-20 cm处取土。分别从草丛、树下各选取4个点取土500 g，去除大颗粒杂质后，在通风良好处干燥24 h，仔细混匀。称取1 Kg预处理过的土壤，加入适量1 g/L的CuCl₂溶液，使土壤中铜含量为10 mg/Kg。适当补水后，放置于干燥通风处，每天添加50 ml的LB培养基并混合均匀，连续操作10 d。