摘 要

目前油田腐蚀问题中，由硫酸盐还原菌（SRB）引起的腐蚀问题较为严重，化学防治方法虽然有一定效果，但仍存在很多弊端。采用微生物防治的方法抑制SRB的生长，是一种经济实用且高效的方法。本文通过研究油田SRB腐蚀原理，筛选出高温反硝化菌，探究其与SRB的抑制机理，为生物防腐奠定技术基础。

本文以武汉市某污水处理厂厌氧段底泥作为泥种，成功选育出了一株具有高效脱氮能力的耐高温反硝化菌，并命名为菌株HT-SN-4。该菌株菌落，颜色为不透明的白色，边缘不规则，湿润易取，菌液为白色悬浊液。

本文通过对菌株HT-SN-4的生长条件优化研究，该菌株的合适氮源为硝酸钾；所需氮源浓度为37.5~75mg/L；适宜 pH范围为7～8，最适pH为7.5。

本文通过在最优实验条件下一起培养菌株HT-SN-4与SRB，探究高温反硝化菌抑制硫酸盐还原菌生长机理，得出菌株HT-SN-4对SRB的生长具有一定抑制作用的结果。

关键词：油田腐蚀，高温，反硝化，硫酸盐还原菌，生物竞争

Abstract

At present, the corrosion problem caused by SRB is more serious in oilfield corrosion problems. Although chemical control methods have certain effects, there are still many drawbacks. Microbial inhibition of SRB growth is an economical, practical and efficient method. In this paper, we studied the principle of SRB corrosion in oil field, screened high temperature denitrifying bacteria, and explored its inhibition mechanism with SRB, so as to achieve the theoretical research of biological anticorrosion.

In this paper, a high temperature denitrifying bacteria with high denitrification ability was selected and named HT-SN-4, taking the sludge of anaerobic section of a sewage treatment plant in Wuhan as a kind of mud.

By optimizing the growth condition of strain HT-SN-4, it is found that the best nitrogen source of the strain is potassium nitrate; the optimum nitrogen source range is 37.5~75mg/L, the optimum pH range is 7~8, the optimum pH is 7.5, the 0~24 h is the adaptation period of HT-SN-4, the logarithmic growth period is 24~54 h, the stable period is 54~66 h, and the 66 h begins to enter the decay period. .

In this paper, strain HT-SN-4 and SRB were cultured under the optimal experimental conditions to explore the mechanism of high temperature denitrifying bacteria to inhibit the growth of sulfate reducing bacteria, and the result of strain HT-SN-4 had a certain inhibitory effect on the growth of SRB.

Key words: oil field corrosion ；high temperature ; denitrification ; sulfate reducing bacteria ; biological competition

目 录

中文摘要 I

Abstract II

第1章绪论 1

1.1 油井腐蚀现状及原因分析 1

1.1.1 溶解盐的影响 1

1.1.2 腐蚀性气体的影响 1

1.1.3 细菌的影响 1

1.2 硫酸盐还原菌（SRB）对油田系统的腐蚀现状 1

1.2.1 硫酸盐还原菌（SRB）简介 1

1.2.2 油田中硫酸盐还原菌的腐蚀现状 1

1.2.3 SRB及硫化物对油田生产的影响 2

1.2.4 SRB的腐蚀对油田产生的危害 2

1.3 油田中的硫酸盐还原菌腐蚀作用机理 2

1.3.1 浓差电池理论 2

1.3.2 阳极区固定理论 2

1.3.3 代谢产物腐蚀理论 2

1.4 SRB的防治方法 3

1.4.1 物理方法 3

1.4.2 化学方法 3

1.4.3 微生物方法 3

1.5 反硝化菌对硫酸盐还原菌的微生物竞争抑制 3

1.6 研究课题的意义及技术路线 3

1.6.1 研究课题的目的及意义 3

1.6.2 研究课题的主要内容及技术路线 4

第2章高温反硝化菌的筛选 5

2.1本章实验概述 5

2.2 实验设备与材料 5

2.2.1 菌株的获取 5

2.2.2 设备与及药品 5

2.3 实验方法 5

2.3.1 培养基配方及实验试剂 5

2.3.2 检测方法 6

2.4 菌株种的筛选 8

2.4.1 高温反硝化污泥的富集驯化 8

2.4.2 高温条件下反硝化菌株的分离和纯化 8

2.4.3 高温反硝化菌的筛选 8

2.5实验结果 9

2.5.1活性污泥的富集和驯化结果 9

2.5.2反硝化菌的分离和纯化 9

2.5.3 高温反硝化菌的筛选 10

2.6 总结 12

第3章高温反硝化菌生长条件的优化 13

3.1影响高温反硝化菌生长因素 13

3.1.1 pH值 13

3.1.2 不同氮源 13

3.1.3 不同氮源浓度 13

3.2 实验方法 13

3.2.1 测定菌株不同pH下的脱氮能力 13

3.2.2 测定菌株不同氮源下的脱氮能力 14

3.2.3 测定菌株同一氮源不同浓度下的脱氮能力 14

3.3 结果与讨论 14

3.3.1 不同的pH对菌株脱氮能力的影响 14

3.3.2 不同的氮源对菌株脱氮能力的影响 15

3.3.3不同浓度氮源对菌株脱氮能力的影响 16

3.4 高温反硝化菌的生长曲线 16

3.4.1 实验方法 16

3.4.2 实验结果与讨论 17

3.5小结 17

第四章高温反硝化菌对硫酸盐还原菌抑制机理研究 19

4.1 前言 19

4.2实验材料 19

4.2.1 菌种来源 19

4.2.2 实验仪器及药品 19

4.2.3 实验所用培养基 20

4.3实验方法 21

4.3.1实验方法 21

4.3.2实验步骤 22

4.4数据分析及结果讨论 22

4.4.1 A组实验结果讨论 22

4.4.2 B组实验结果讨论 23

4.4.3 C组实验结果讨论 23

4.4.4 培养基含氮量对比 24

4.4.5 培养基硫离子对比 25

4.5本章小结 25

第5章 结论 27

致谢 28

参考文献 29

第1章绪论

1.1 油井腐蚀现状及原因分析

油田腐蚀问题是现代油田发展过程中的一直存在的较为严重的问题。油田中的腐蚀物质会腐蚀破坏生产设备，使设备不能正常运行，甚至会导致重大生产安全事故。因此，探究油田腐蚀的根本原因，并提出解决办法，对油田的正常运转具有重大的理论和实践意义。

1.1.1 溶解盐的影响

目前开采的油田中的溶解油和工业注水具有较高的盐度，这增强了水的电导率，导致金属表面无法形成致密物，显著影响对油井的腐蚀度[^[1]]。

1.1.2 腐蚀性气体的影响

酸性气体，包括CO₂、溶解氧和H₂S，会对油井造成大面积腐蚀[^[2]]。其中，油田生成的H₂S在水中溶解后，会发生电力反应，导致金属材料的表面破裂，抽油杆的断裂等严重问题。

1.1.3 细菌的影响

油井中的细菌主要包括：硫酸盐还原菌（Sulfate-reducing bacteria—以下简称SRB）、铁细菌、腐生菌等[^[3]]。其中，在厌氧条件下，SRB可以将废液中的硫酸盐还原为硫化氢，从而腐蚀金属，是对油井腐蚀作用最强的细菌之一。

1.2 硫酸盐还原菌（SRB）对油田系统的腐蚀现状

1.2.1 硫酸盐还原菌（SRB）简介

SRB是一些厌氧条件下呼吸产物生成硫化氢的细菌的统称，是以有机物为养料，将SO₄^2-中的S⁶ 还原成S^2-，进而生成副产物H₂S的厌氧菌[^[4]]。SRB是一种革兰氏阴性菌 [^[5]]。SRB的呼吸产物中的高浓度H₂S会导致环境pH变为酸性，改变金属的状态，进而使金属腐蚀速率变大。

在厌氧条件下，SRB将乳酸或丙酮酸等简单的有机物作为电子供体，并通过硫酸盐为电子受体来还原SO₄^2－成S^2－。其呼吸总反应为[^[6]]：

2CH₃CHOCOOH SO₄^2－ 4H →2CH₃COOH 2CO₂ S^2－ 3H₂O

1.2.2 油田中硫酸盐还原菌的腐蚀现状

在厌氧条件下，SRB会大量繁衍，堵塞物料输送管道，会使管道设施的局部腐蚀、穿孔，对工业水注入系统以及其他油田设备带来了严重的危害，造成巨大的经济损失[^[7]]。

在石油的油田二次注水系统中，厌氧条件下[^[8]]的SRB会生在在管道表面，群居繁殖，腐蚀管道表面。其腐蚀特点为；黑色腐蚀产物沉积在腐蚀坑内；腐蚀产物下的金属表面光滑；蚀刻坑具有圆锥形横截面的圆形表面和坑内的同心环 [^[9]]。

1.2.3 SRB及硫化物对油田生产的影响

SRB及其产物对油田生产的主要影响[^[10]]：损坏生产设备；降低产品质量；污染环境，危害人体健康。在石油工业中，硫酸盐还原菌不光会导致设备管道的腐蚀和损坏，同时给聚驱二次采油带来较大的风险[^[11]]。

1.2.4 SRB的腐蚀对油田产生的危害

SRB的腐蚀不仅会对油田的整个生产工艺产生影响，还会严重损坏生产系统的生产设备，同时造成巨大经济损失。据中石油天然气总公司1992年的统计[^[12]]，油田每年的腐蚀损失约2亿元，其中SRB的腐蚀是造成该现象的一大原因；美国油田因微生物腐蚀每年的直接损失达400～600亿美元[^[13]]，其中77%以上的腐蚀源于SRB腐蚀[^[14]]。SRB的呼吸产物H₂S及生成的硫化物不仅会污染环境，同时对油田工作者带来极其严重的身体伤害[^[15]]。

1.3 油田中的硫酸盐还原菌腐蚀作用机理

1.3.1 浓差电池理论

Starkey[^[16]]在1958年提出，当存在FeS等腐蚀产物时，金属管道部分表面会形成浓差电池。这种情况的腐蚀通常伴随着厌氧腐蚀，在金属表面的腐蚀产物附近形成适合SRB生长的低氧区，从而加速腐蚀效率。Evans等[^[17]]也认为：金属表面的浓差电池会加速金属的腐蚀。

1.3.2 阳极区固定理论

Pope等[^[18]]提出的阳极区固定机理，其理论在于较小孔蚀形成后，内表面微环境较稳定，在稳定的微环境中SRB菌群为相对的阳极，金属贴为阴极，加速腐蚀的进行。

1.3.3 代谢产物腐蚀理论

在其生长繁殖过程中，SRB会生成大量的硫化氢，这会改变金属表面的环境，并导致腐蚀的加速 [^[19]]。硫化物会引起局部金属腐蚀，腐蚀过程中生成的氢会引起金属结构的氢脆。

1.4 SRB的防治方法

1.4.1 物理方法

紫外线照射和超声波处理：一般紫外线灯在260nm波长处具有辐射杀伤力，这个波长恰好可以被核酸所吸收[^[20]]。因而，紫外线照射一段时间可以杀死SRB。超声波对SRB的生长也有抑制作用。声波频率在9020kHz/s以上的超声波可以使细菌内容物受到破坏性强烈振荡[^[21]]，从而消除SRB。

1.4.2 化学方法

化学方法是目前行之有效的控制SRB腐蚀的方法[^[22]]。主要方式是通过添加杀菌剂对SRB进行杀除，或加入化学抑制剂对SRB进行生长的抑制。这种方法各大油田中被大规模采用。

1.4.3 微生物方法

微生物预防和控制是通过细菌的共生和竞争以及菌落置换的生物竞争抑制(BCX)作用[^[23]-[24]]，以消灭有害微生物，并除去其生成的有害产物。该方法的作用机理为：在同一生长环境中，替代菌会挤占生存空间和营养物质，导致SRB的生长受到抑制。并且，替代菌的生长条件和代谢底物与SRB极其相似，但其呼吸产物不含H₂S，或能将硫化氢进一步转化为其他物质，从而降低SRB的腐蚀带来的危害[^[25]]。

反硝化菌[^[26]-[27]](Denitrifying Bacteria，以下简称DNB)是具有竞争优势的拮抗菌。其与SRB的生长环境和代谢底物近似，但不生成H₂S等对环境有害的产物。

1.5 反硝化菌对硫酸盐还原菌的微生物竞争抑制

SRB与DNB都属于厌氧菌，且两者生长环境极其相似。当基质有限时，两者之间会存在关于生存空间和生长基质的竞争。Achtnich等[^[28]]研究表明，DNB在与SRB的竞争中占据优势。在基质充足时，DNB对SRB的竞争抑制作用不十分明显[^[29]]。

1.6 研究课题的意义及技术路线

1.6.1 研究课题的目的及意义

硫酸盐还原菌在我国大庆油田地面系统中大量生长，导致硫化物、悬浮固体含量增加，引发如湍流电场等严重的生产事故，而采用化学方法治理，会对油田周围环境造成巨大的伤害，危及工作人员的健康。根据目前油田杀灭硫酸盐还原菌的状况，提出反硝化抑制硫酸盐还原菌活性的设想。

近年来，关于高温反硝化菌的报道逐渐丰富。然而这些报道的高温反硝化菌大多生长于25~35℃的常温环境下，关于60℃以上的高温条件下的高温反硝化菌报道较少。

由于油田的废水温度较高，所以本研究将筛选出耐高温(65℃以上)的反硝化菌株，并对其在高温条件下抑制SRB生长机理进行研究，为其在高温油田的应用提供理论指导。

1.6.2 研究课题的主要内容及技术路线

本论文的研究主要内容主要如下几个方面：

（1）筛选分离高温反硝化菌。从不同的污泥中筛选高效的高温反硝化菌，通过富集驯化、蓝白斑筛选及培养液总氮去除效果的测定，从中挑选出反硝化能力较好的菌株。

（2）优化高温反硝化菌的发酵条件。筛选适合菌株生长和高效处理的培养基，比较不同氮源、氮源浓度、初始pH值对菌株生长和反硝化效率的影响，获得最适合的发酵条件。

（3）对DNB进行菌剂复配，探究不同初始值pH、不同氮源和氮浓度对复配菌剂的总氮去除性能影响。

（4）研究最优条件下的菌株对SRB的抑制机理。通过对同一初始培养基内不同时段内的总氮、硫离子浓度和OD₆₀₀的测定，判断DNB对SRB是否有抑制作用。本论文的研究技术路线如图1.1所示：

图1.1技术路线

第2章高温反硝化菌的筛选

2.1本章实验概述

初筛和复筛是高温反硝化菌的筛选过程中重要步骤。初筛是指根据目标条件，利用适宜的培养基，对目标菌株进行聚集和生长习性的驯化。通过对过程中的目标产物的检测来判断菌株的富集进度，当富集工作完成后，再根据实验要求的条件，对菌株进行筛选和纯化，从而分离出实验所需要的纯菌株。复晒则是通过初筛的菌株进行例如反硝化能力等功能进行鉴定，以确定所筛选的最终的菌株是目的菌株。

2.2 实验设备与材料

2.2.1 菌株的获取

选自某污水处理厂的厌氧阶段的活性污泥。

2.2.2 设备与及药品

表2.1实验所用设备仪器型号及生产厂家

表2.2实验所用试剂型号及生产厂家

2.3 实验方法

2.3.1 培养基配方及实验试剂

（1）反硝化富集培养基：KNO₃ 1g，柠檬酸钠5g ，KH₂PO₄ 1.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂ 0.2g，Na₂HPO₄ 4g， NaNO₂ 0.5g，NH₄Cl 0.5g，微量元素2mL，蒸馏水1000mL

（2） 反硝化分离培养基：柠檬酸钠 5g，KNO₃ 1g，Na₂HPO₄ 4g，KH₂PO₄ 1.5g，琼脂 20g，微量元素2mL，MgS0₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂ 0.2g，蒸馏水1000mL。