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脲酶：功能、催化作用和动力学性质的研究进展

Barbara Krajewska

摘要：脲酶 (尿素酰胺基水解酶，EC 3.5.1.5) 是一类高效的酶，它们广泛分布于自然界中，其功能是催化水解尿素，最终产物为碳酸和氨。脲酶催化作用的两大特征分别是形成碳酸和氨等产物，同时形成这些产物的过程中使环境pH值上升。除去其在自然界中的意义，尿素的酶促催化水解反应在实际应用中也具有巨大潜力。考虑到这种重要性，本文提供的关于酶性质的叙述中，除了既有的知识外，也介绍了最新发表的成果。值得注意的是，由于其功能和应用特性，脲酶在许多重要领域，尤其是医疗、分析、环境科学和工程学等方面的应用有待探究和开发。

关键词：脲酶、性能、地位、特征、研究进展

1.绪论

脲酶（尿素酰胺基水解酶，EC 3.5.1.5）是一类自然界中广泛存在于植物、细菌、真菌、藻类和无脊椎动物体内的酶；尽管它们具有不同的蛋白质结构，但在作用上是一致的，即将尿素水解为氨和碳酸，这个看似简单的作用通常被视为自然界中尿素无处不在的证据。在功能上，脲酶被归入酰胺水解酶和磷酸二酯酶类。这些酶的主要共同特征是，在活性部位中存在着作用为激活反应底物和水的金属中心。同双核金属水解酶属的其他成员相比，脲酶的特征是它们在活性部位具有Ni（II）离子。

脲酶促催化水解中反应中的脲酶和尿素这两个主要组分，在自然科学的发展过程中扮演了特殊的角色。尿素于1773年首次由Hillaire M. Rouelle在人尿中发现，后来又成为以无机材料合成的第一种有机化合物（Wouml;hler，1828年）。由尿素发酵得到尿中的氨的方法最早是在1798年由Fourcroy和Vauquelin研究得到，但首例基于微生物学的尿素分解方法(利用微球菌脲酶的方法)是在更晚的1864年由van Tieghem发现。另外，第一例尿素分解酶由Musculus在1874年从腐尿中分离成功，并于1890年由Miquel发表，它被命名为脲酶。1909年竹内在大豆中发现了脲酶的研究在另一方面保证了日益壮大的酶研究丰富的原料来源。1926年James B. Sumner结晶刀豆脲酶的工作首次指出酶是蛋白质并可结晶，这项工作被视为生物化学史上的一座里程碑。同样重要的是，由Dixon等在1975年确定，刀豆脲酶初步显示了具有在活性位点的镍离子对酶的活性是必要的。

自竹内的发现以来，脲酶已成为被广泛研究的课题主体。相关热门研究对象包括其存在范围与在自然界中担任的角色、功能性机理、行为特异性以及外复合反应等。近年的主要科研方向有：氨基酸测序，抑制剂作用下的天然脲酶、突变体及复合体的晶体结构以及遗传构成。人们迫切需要了解脲酶的催化机理的分子基础依据，这方面的认知对于酶促过程的控制是至关重要的，包括自然现象和人工设计过程中发生作用的酶。后者已在理论研究的基础上实现，使得脲酶的潜在作用逐渐被挖掘并应用于诸如实验室、工业生产和生物技术研究中。

本文从酶促过程的意义及其在实际应用上的开发可能两个方面，对脲酶的特性作出综述，包括一些既有的知识以及最新发表的成果。我们特别重点研究了脲酶的功能性和实际表现出的性质，这么做也是鉴于有意把这篇文章当作我们另一篇即将发布的关于如何将脲酶通过固定化作用进行改性的文章的引言。文中引用了大量的参考以作为来源文献的索引。

2. 尿素的酶解和脲酶的性能

脲酶催化的反应是尿素的水解，其产品是氨基甲酸盐和氨，而后前者进一步自发水解为氨和另一分子碳酸（图1）。

图1

否则，由于共振能高达约30-40 kcal/mol，使得尿素在水溶液中高度稳定且耐腐蚀性良好。尿素在水溶液中观察到的非催化分解也同理论相符，即为一个消除反应，其产物是异氰酸酯和氨（图1）。实验中可观察到反应进行缓慢，当pH介于2和12之间时，反应速率与酸碱度无关。另一方面，尿素的非催化水解从未被观察到。这些特征使得评估脲酶催化能力变得困难。这是由于，催化能力定义为自由酶促反应的有效二阶速率常数k_cat/K_M和非催化反应的速率常数k_uncat之比，以至于在需要速率常数k_cat和k_uncat在酶存在与否的两种反应条件下都能测得。最近，为估计脲酶的实际性能，研究者们进行了对非催化水解常数k_uncat的理论推导，其中一项数据来自1,1,3,3-四甲基脲（Me4U）和另一个机械模拟的水解数据。它们同尿素非催化分解以及酶水解的实验结果一起编入表1。这些数据表明，在Me4U的数据下，脲酶作为一种酶在效率、反应速率增益和催化性能上与其他相对高效的C-N水解酶相当。然而，从机械模拟结果看，在10³⁰倍折率强化和强行提高至10³²倍的性能测试中，尽管有些高估，脲酶仍可被分至已知性能最好的酶一类。

有趣的是，脲酶的水解行为最近受到了来自量子化学和分子动力学的挑战，模拟结果表明消除效应会同水解反应形成竞争关系。然而尽管如此，两种机制的结果仍然导向相同的终产物：碳酸和氨（图1）。实际上，这个假设同早先对脲酶作用于氰酸盐机理的讨论与最近基于镍中心模型的实验评估保持一致。

表1a尿素在非催化和脲酶催化下分解的的动力学常数是在自然pH和38℃下测得的

表1b速率增益和脲酶催化分解尿素的性能相对于尿素的非催化分解

a项理论数据取自1,1,3,3-四甲基脲（Me4U）的水解。

b项理论数据取自机械模拟。

3. 脲酶的存在方式及其功能

脲酶是自然界中的常见物质，他们可以在许多有机体中被合成，如植物、细菌、藻类、真菌和无脊椎动物等，也作为一种土壤酶存在于土壤中。提供反应的尿素基体是很容易获得的，它主要是通过动物排尿行为和死去的有机体中含氮化合物的降解，并且同时起肥料的作用。因此，由于尿素的存在，脲酶在自然界氮循环中有重要意义。他们的关键作用是给有机体的生长提供胺形式的氮元素。

3.1. 植物中的脲酶

除醛缩酶外，脲酶也是植物至关重要的尿素分解酶，用于在吸收尿素以后催化分解加以利用。尽管还未研究透彻，但种种迹象表明更高级的植物可能拥有多种更主动的尿素的转移系统，可以帮助它们根据获得的含氮化合物种类来最优化氮元素的分配。植物通过根吸收尿素，但是主要通过尿素合成胺，施肥实验的发现证实这一过程因土壤中的脲酶而成为可能。值得注意的是大量输入的氮元素同时会对植物和环境造成危害。为了增强施肥，尿素通过腐叶被植物吸收。然而，虽然通过落叶吸收尿素十分高效，但在高浓度时是有毒的。很明显我们需要更深入地研究植物营养机理中和尿素相关的部分，才能开发出更合理的尿素施肥方案，从而获得最优且可持续的农作物培植手段。

另一方面，在植物的细胞中，尿素参与含氮化合物的代谢过程。这一点上，除了从外界环境中得到的，尿素在植物内部主要通过两个代谢过程获得：精氨酸酶催化分解和脲态氮以及嘌呤的降解。因为代谢速度很快，尿素实际上并不累积，然而持续的产生使得它们可以看作是一个氮元素的来源。这里存在另一个假说：由于胺的生产，尿素也有攻击病原体的作用。同时，最新研究表明，由于其分解的独立性，尿素也表现出杀虫和抵抗真菌的性质，这意味着他们在植物的防御系统中发挥作用。绝大多数的植物中，尿素在豆类植物的种子内储量尤为丰富。其中大豆包含0.012%干重的尿素，而刀豆中则占有0.07%到0.14%干重，后者因此成为最常见的脲酶的来源。

3.2. 可分解尿素的细菌对人和动物的致病性

在数目众多的分解尿素的细菌中，有一部分引起了特别的注意，它们对人和动物均具有致病性。其致病性源于尿素水解过程，导致ph升高（至9.2）并且释放有毒的胺和衍生物。尿素作为氮元素主要的代谢废物，对于大多数陆地动物来说产生于肝脏，并由血液循环系统进入肾脏，通过尿液被排出体外，它的浓度在健康人的血清中大概为1~10mM，而尿中浓度在0.5M左右。而且，20%~25%的所有的尿素产生都是在消化系统中，胃部的浓度为1.7~3.4mM。这样一来，尿素可以很方便迅速的被传递给分解尿素的细菌，造成最常

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