摘 要

自然光合作用是生物体将太阳能转化为化学能的主要途径，但其太阳能转化效率较低。通过开发混合光合作用系统，将无机光催化材料与微生物结合起来，可实现太阳能到化学能的高效转化，从而促进微生物的新陈代谢、提高其化合物产品的产量。本文采用光催化剂石墨相氮化碳（g-C₃N₄）来提高真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16的PHB产量，重点探究了光照强度对其作用效果的影响。PHB是该菌株产生的一种热塑性聚酯，用于生物体碳源和能源的储备，也是一种性能优良的生物可降解材料。在这种混合光合体系中，g-C₃N₄获得光能并释放能量，该能量被R. eutropha H16用来进行自我生长、繁殖并储存PHB。实验结果表明，随着光照强度的增强，R. eutropha H16菌株的PHB产量先增加后减少，在最佳光强2100LUX作用下，其PHB产量约为黑暗条件下的1.65倍。该研究为微生物生产工艺条件的改进提供了一条可行的途径，即可以通过构建混合光合体系并改变其光照条件来提高菌株产量，降低生产成本。

关键词：PHB；Ralstonia eutropha H16；光照强度；混合光合体系

Abstract

Natural photosynthesis is the main way for organisms to convert solar energy into chemical energy, but its solar energy conversion efficiency is low. By developing a hybrid photosynthesis system, inorganic photocatalysts can be combined with microorganisms to achieve efficient conversion of solar energy to chemical energy, thereby promoting the metabolism of microorganisms and increasing the yield of their compound products. Graphite phase carbon nitride (g-C₃N₄) as a photocatalyst was used to increase the production of PHB of Alkalibacillus Eutrophica Ralstonia eutropha H16. The effect of light intensity on its effect was investigated. PHB is a thermoplastic polyester produced by the strain, which is used for carbon and energy storage of organisms, and is also a biodegradable material with excellent performance. In this mixed photosynthetic system, g-C₃N₄ obtains light energy and releases energy, which is used by R. eutropha H16 for self-growth, reproduction and storage of PHB. The results showed that with the increase of light intensity, the PHB production of R. eutropha H16 strain increased first and then decreased. There was an optimum light intensity of 2100 LUX, and its PHB production was about 1.65 times of that under dark conditions. This study provides a feasible way to improve the microbial production process conditions, that is, to improve the strain yield and reduce production costs by constructing a mixed photosynthetic system and changing its light conditions.

Key Words：PHB；Rastonia eutropha H16；Intensity of illumination；hybrid photosynthesis system

目录

第1章 绪论 1

1.1 概述 1

1.2 聚β-羟基丁酸酯（PHB）简介 2

1.2.1 PHB结构与性能 2

1.2.2 PHB的合成方法 3

1.2.3 PHB的提取方法 5

1.3 光催化剂（g-C₃N₄）的选用 6

1.4 关于构建无机-生物混合体系的研究进展 7

1.5 本课题研究内容及意义 8

1.5.1 主要研究内容 8

1.5.2 研究意义 8

第2章 实验材料与方法 10

2.1 实验试剂与仪器 10

2.1.1 实验试剂 10

2.1.2 实验仪器 11

2.2 实验材料 11

2.2.1 菌株及其培养过程 11

2.2.2 培养基 11

2.2.3 光催化剂的合成 12

2.2.4 电子供体（TEOA）的选用 12

2.3 实验检测方法 13

2.3.1 光催化剂（g-C₃N₄）的表征方法 13

2.3.2 气相色谱法 14

2.3.3 高效液相色谱法（HPLC） 14

第3章 结果与讨论 15

3.1 光催化剂（g-C₃N₄）的表征结果 15

3.2 实验结果与讨论 17

3.3 g-C₃N₄与Ralstonia eutropha菌之间的电子转移 20

3.4 结论 21

参考文献 22

致谢 24

第1章 绪论

• 1. 概述

近年来，我国塑料制品行业发展迅速，增长速度一直稳定保持在10%以上，塑料制品在工业生产和人们生活的方方面面都发挥着越来越重要的作用。但塑料废品的自然降解耗时长、难度大，大量堆积造成的环境污染问题也日益严重。目前对于废弃塑料制品的处理办法主要有两种：填埋法和焚烧法。填埋法不仅会占用大量宝贵的土地资源，而且地下含氧量少，塑料降解速度更为缓慢，有研究表明填埋塑料地下存在时间可达20年之久。焚烧法虽然在一定程度上规避了填埋法占用土地资源的弊端，但大量塑料焚烧会加剧温室效应，塑料中含有的氮、磷、硫、卤素等释放到空气中，不仅会污染空气，还可能形成酸雨，对人们的生活造成危害^[1]。随着“可持续发展”理念逐渐深入人心，这一问题引起了世界各国的广泛关注。因此，各国争相在新型塑料领域投入人力与资金，试图研发出能够替代传统塑料的生物可降解塑料。同时，寻找一条绿色高效的生物可降解塑料的合成途径同样重要，并引发了越来越多科学家的关注。

聚β-羟基丁酸酯，简称PHB，是一种由细菌发酵产生的热塑性聚酯。在细胞质中呈颗粒状，平时积累在细菌体内，主要作用是为菌体储备碳源和能源。与传统塑料相比，PHB有着与其相同的力学性能，如拉丝、成膜、压塑等。此外，PHB还因其环境友好的性质特点，成为了研究关注的热点，在众多领域取得广泛应用。首先PHB具有生物可降解性。经过微生物作用的终产物只有水和二氧化碳，对生态系统尤其是碳循环系统没有不良影响，故PHB是极好的化学合成塑料的替代品。其次，PHB作为一种微生物合成材料，具备良好的生物相容性。进入机体后，经过一系列反应最终变成水和二氧化碳排出体外，对机体不会造成负担。因此，相比于经过化学反应制备、容易掺杂并引发抗原抗体反应的化学合成材料，PHB成为临床上一种更受欢迎的生物材料。此外，PHB还具有优秀的阻隔性能、高结晶性、手性等特点^[2]。

太阳能通过自然光合作用形成有机物的转化速率缓慢，从而阻碍了我们试图获取更多太阳能量的工作进程。人们通过利用储量丰富的碳质能源暂时规避了这一局限性，并促进了工业、农业、城市和人口的快速发展。然而，石油化学品日益减少，严峻的发展压力急需光合作用的回归，即一种能够与现代社会发展同步的新型光合作用。大量研究表明，无机半导体材料的光吸收效率普遍大于植物。相比之下，合成催化剂却仍然难以促进生物学中复杂的C-C键的形成。利用二氧化碳生产太阳能化工产品有望减少石油化学品的消耗，无机半导体光催化剂和微生物相结合的混合系统为此提供了一条可行的前进道路。通过对几种无机-生物混合体系的研究，对太阳能至化学品生产技术的研究与开发已取得了重大进展^[3]。

目前，利用无机-生物混合体系生产乙酸、乙醇、PHB等有机物已取得了突破性进展，通过构建无机-生物混合体系生产新型可降解塑料不仅可以缓解传统塑料污染带来的环境压力，而且该法具有清洁高效的优点，可有效提高生产效率、节约生产成本。

• 1. 聚β-羟基丁酸酯（PHB）简介
     1. PHB结构与性能

聚β-羟基丁酸酯（Poly-β-hydroxybutyrate）,是聚羟基脂肪酸酯（PHAs）中的一种线性高分子聚合物，由多个D型3HB单元组成，分子量随培养条件和提取方法的不同变化较大，其范围为一千至两百多万，分子结构如图1.1所示。

图1.1 PHB结构式

其单体为3-羟基丁酸，分子式为C₄H₈O₃，分子量104。PHB不溶于水、甲醇、乙醇、醚及丙酮等，微溶于甲苯、辛醇、吡啶等，易溶于含有卤素的有机溶剂，如氯仿、二氯乙烷、二氯乙酸等。PHB有着与聚丙烯（PP）相似的分子结构和物理性质，对比PHB与聚丙烯（PP）的性质如表1.1所示^[4]。

由表1.1可以看出，PHB的晶体熔点、结晶度、玻璃化转变温度、分子量及拉伸强度都与聚丙烯相近，机械性能和耐溶剂性能较差，受热易分解，加工困难，但其相对密度大、光学活性好、抗紫外辐射、压电性、生物可降解性和相容性均优于聚丙烯。

表1.1 PHB和聚丙烯一些性质的比较

• • 1. PHB的合成方法

PHB的合成方法主要有三种：化学合成法、基因合成法和微生物合成法。

（1）化学合成法

PHB及其单体3-羟基丁酸的实验室化学合成技术已经相对成熟，主要有化学催化法制备PHB、β-丁内酯水解制备β-羟基丁酸、利用Reformatsky反应、还原反应、利用蔡铿催化剂制备、丁烯酸水合反应、水解法、氧化法等方法合成。除化学催化法可直接合成PHB外，其余方法均只能得到单体3-羟基丁酸，再经聚合得到最终产品聚羟基丁酸酯（PHB）。

（2）基因合成法

如今利用转基因技术在植物体内生产淀粉、蔗糖、维生素及脂肪酸等已成为现实，作为生物体内的一种储能物质， PHB具有与淀粉、蔗糖、维生素、脂肪酸等类似的结构。虽然植物本身不能合成PHB，但利用转基因技术将编码PHB合成相关酶的基因导入植物体内，并进行表达，即可得到产物PHB。

（3）微生物合成法

1925年法国微生物学家Maurice Lemoigne首次在巨大芽孢杆菌（Bacillus megatherium）体内发现了PHB，并于1927年将其从菌体中提取出来。但在发现之初，这一新型材料并没有在科学界掀起大的波澜，直到1958年有科学家发现PHB能够被蜡样芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌快速降解，关于PHB及其他形式PHAs的研究才日益增加。发掘其他微生物及其微生物聚合物的潜在性能、利用微生物发酵生产PHB成为了研究的热点。PHB的生物合成途径主要有三步合成法和五步合成法两种。大多数微生物均通过三步代谢途径来合成PHB，首先，乙酰辅酶A在β-酮硫解酶的催化作用下转化为乙酰乙酰辅酶A；其次，乙酰乙酰辅酶A还原酶催化乙酰乙酰辅酶A生成D(-)3-羟基丁酰CoA；最后，在PHB合成酶的催化作用下，D(-)3-羟基丁酰CoA转化为PHB。五步合成法与三步合成法过程类似，仅在第三步和第四步有较大差别。第二步中，乙酰乙酰辅酶A经催化合成的产物为L( )3-羟基丁酸辅酶A，经立体专一的烯酸基辅酶A两步催化后生成D(-)3-羟基丁酰CoA。具体合成路径见图1.2与图1.3。

与微生物合成法相比，化学合成法在一定程度上能够降低生产过程对环境的依赖性，提高产量，降低生产成本；但化学合成法同时存在部分原料价格昂贵、毒性较高、反应条件苛刻、产率较低、副反应和副产物较多，分离与提纯困难、环境污染严重等问题。基因合成法以植物本身作为反应器，利用其廉价的碳源，不需要价格昂贵的发酵底物和复杂的发酵后续处理过程，降低了生产成本；但利用植物生产PHB同时存在底物运输障碍、基因表达及功能实现障碍、提取困难、遗传学障碍等问题。故目前一般采用微生物法生产PHB。

图1.2 PHB三步合成路径^[5]

图1.3 PHB五步合成路径^[5]

1.2.3 PHB的提取方法

PHB是一种胞内大分子聚合物，不溶于水，可被降解。提取PHB时,不仅要考虑提取过程对聚合物的结构、分子量的影响，同时应考虑提高其提取率与纯度、提取方案的经济性与对环境的污染程度等。目前，从微生物细胞内提取PHB的方案主要有有机溶剂法、酶法、次氯酸钠法、机械破碎法等等^[6]。

（1）有机溶剂法

有机溶剂法要求选用的有机溶剂既能改变细胞壁和细胞膜的通透性，又能够溶解PHB，而不溶解除PHB以外的其他细胞物质（NPCM）。常用的有机溶剂包括氯仿、四氢呋喃、二氯乙烷、碳酸乙烯酯、乙酸酐等等。其中，氯仿是实验室最常用到的一种良好的提取剂。有机溶剂法提取PHB的降解率低，且纯度较高，但提取率难以达到很高，使用大量有机溶剂造成原料浪费，且有机溶剂大多易燃易爆，污染环境。故有机溶剂法一般用于实验室研究。

（2）酶法

酶法的提取原理与有机溶剂法类似，区别在于溶解非PHB的细胞物质，而不溶解PHB。除PHB外细胞中还含有磷脂、核酸、蛋白质等多种物质，这就要求处理时需多种酶共同作用。但大多数酶对作用条件要求严格，且利用该法提取PHB得到的产物含杂质较多，产品分离步骤复杂，生产成本随之提高，故酶提取法很难应用于工业化生产之中。

（3）次氯酸钠法

次氯酸钠法是另一种提取PHB的方法。次氯酸钠能够迅速破坏细菌的细胞膜和细胞壁，并对胞内物质进行消化降解。该法具有PHB提取速度快、产品纯度高的优点。但由于次氯酸钠具有强氧化性，对PHB分子具有极强的降解作用，所得的PHB分子量较低。

（4）机械破碎法

机械破碎法是一种常用来提取胞内蛋白的细胞破碎方法，常采用高压均质和高速珠研磨法。细胞壁是机械破碎的主要障碍，故在机械破碎前可使用化学试剂预先处理以降低细胞壁强度，进而减少操作压力或通道数。这种方法具有操作简单、稳定可靠、效果好、不破坏细胞内含物质、无污染等优点。

• 1. 光催化剂（g-C₃N₄）的选用

光催化反应，即在太阳能的驱动下，催化降解各类有机化合物或分解水产生氢气和氧气的反应，具有清洁、高效、低能耗等优点，引起了越来越多科学家的关注。

在光催化剂和电子供体存在的条件下，光驱动Ralstonia eutropha菌提高PHB产量的原理为：光催化剂受到大于或等于其禁带宽度的光照时，价带电子在吸收了光子的能量后就会越过禁带跃迁到导带，而成为光生电子（e^-），原价带因电子跃迁而出现光生空穴（h ），培养基中的氢离子捕获光生电子就会提高还原当量的产生，促进生物体内NADPH与NADP 之间的转化，进而促进菌体的生长，提高其生产PHB的能力。在众多光催化材料中，TiO₂稳定性强、价格便宜因而也被研究最多、应用最广。但TiO₂具有很大的禁带宽度（3.0-3.2eV），只有在紫外光的驱动下，才能发生明显的光催化反应。而紫外光只占太阳能总能量的4%左右，这极大地限制了TiO₂在实际生产中的应用。同时TiO2具有一定的杀菌性能，无法在微生物系统中直接与生物体接触。