摘 要

近年来，具有多重耐药性的超级抗性基因被陆续检出，因具有易传播和耐药广的特性而展现出了严峻的生态健康风险，但目前对其在水环境中的影响因素研究较少。为此，本课题研究了微生物群落结构变化和环境因子对以MCR-1和NDM-1为代表的超级抗性基因丰度与耐药特征的影响。通过对自来水厂、污水厂和长江下游（南京段）22个点位进行检测分析，发现MCR-1丰度与营养物质呈正相关，与浊度呈负相关，其携带菌的耐药能力与NO₃^--N呈正相关，与COD、NH₃-N等呈负相关。NDM-1丰度与浊度呈正相关，其携带菌的耐药能力与COD、NO₂^--N呈正相关。通过对自来水厂8个点位进行高通量测序和分子生态网络图分析，发现MCR-1的宿主细菌大部分亲缘关系近，NDM-1的宿主细菌广泛，存在基因水平转移。水质特征和微生物群落变化共同影响了超级抗性基因的分布，上述结论为控制水环境中的超级抗性基因提供了依据。

关键词：MCR-1 NDM-1 分子生态网络图 RDA

The factors affecting the abundance and super antibiotic resistance genes in water environment

Abstract

In recent years, super resistance genes with multi-drug resistance were detected in succession, shown more severe health risks because of their easy transmission and broad drug resistance. But there are few researchs on the factors affecting it in the water environment. Therefore, this resrarch investigated the effects of microbial community structure changes and environmental factors on the abundance and drug resistance of super-resistant genes represented by MCR-1 and NDM-1. Through the detection and analysis of 22 points in the drinking water treatment plants, wasterwater treatment plants and the downstream of the Yangtze River (Nanjing section). It was found that the abundance of MCR-1 was positively correlated with nutrients and negatively correlated with turbidity. The drug resistance of the carrier was positively correlated with NO₃^--N and negatively correlated with COD and NH₃^--N. NDM-1 abundance was positively correlated with turbidity, and its resistance to bacteria was positively correlated with COD and NO₂^--N. Through high-throughput sequencing and molecular ecological network analysis of 8 points in the drinkwater treatment plant, it was found that the host bacteria of MCR-1 were mostly related, and the host bacteria of NDM-1 were extensive and there were gene level transfer. The water quality and microbial community changes affect the distribution of super-resistance genes. The above conclusions provide a basis for controlling super resistance genes in water environment.

Key Words: MCR-1; NDM-1; network; RDA

目 录

摘要…………………………………………………………………………………Ⅰ

ABSTRACT………………………………………………………………………Ⅱ

第一章 绪论………………………………………………………………………1

1.1 水环境中抗性基因和耐药细菌的概述……………………………………1

1.1.1 水环境中抗性基因和耐药细菌的来源……………………………1

1.1.2 水环境中抗性基因的转移和扩散…………………………………1

1.2 抗性基因在水环境中的检出和分布………………………………………2

1.2.1 污水…………………………………………………………………2

1.2.2 地表水………………………………………………………………2

1.2.3 地下水………………………………………………………………3

1.2.4 饮用水………………………………………………………………3

1.3 超级抗性基因………………………………………………………………3

1.4 抗性基因和耐药细菌在环境中分布的影响因素…………………………4

1.4.1 微生物群落…………………………………………………………4

1.4.2 环境因子……………………………………………………………5

1.5 研究的内容和技术路线……………………………………………………5

第二章 材料与方法………………………………………………………………6

2.1 取样…………………………………………………………………………6

2.2 水质分析……………………………………………………………………8

2.3 DNA提取……………………………………………………………………8

2.4 荧光定量PCR………………………………………………………………9

2.5 MCR-1和NDM-1宿主菌株的分离………………………………………10

2.6 MCR-1和NDM-1菌株耐药特征的测定…………………………………10

2.7 自来水厂微生物高通量测序………………………………………………10

2.8 数据分析……………………………………………………………………11

2.8.1 耐药细菌对抗生素的存活曲线拟…………………………………11

2.8.2 网络图分析…………………………………………………………11

2.8.3 RDA分析…………………………………………………………12

第三章 结果与分析……………………………………………………………13

3.1 超级抗性基因的丰度和耐药特征的变化…………………………………13

3.1.1 污水处理厂…………………………………………………………13

3.1.2 长江流域南京段……………………………………………………13

3.1.3 自来水厂……………………………………………………………14

3.2 微生物群落结构……………………………………………………………15

3.2.1 微生物群落结构演变………………………………………………15

3.2.2 微生物群落多样性变化……………………………………………17

3.3 超级抗性基因影响因素……………………………………………………18

3.3.1 微生物群落结构……………………………………………………18

3.3.2 环境因子……………………………………………………………21

第四章 结论与展望……………………………………………………………23

参考文献…………………………………………………………………………24

致谢………………………………………………………………………………27

第一章 绪论

• 1. 水环境中抗性基因和耐药细菌的概述
     1. 水环境中抗性基因和耐药细菌的来源

抗生素是天然存在的或人造的化合物，从1942年青霉素被引入药物治疗以来，已经分离合成了数百种其他抗生素用于治疗人和动物感染[1]。然而由于这些化合物不能被人和动物完全代谢吸收，仍有50%~90%的抗生素被排出体外[2-3]，进入水体或土壤，造成污染。在长期一定浓度的抗生素的毒害作用下，会导致敏感生物产生抗性基因（ARGs）和耐药细菌（ARB）[4]。世界卫生组织将抗性基因和耐药细菌定性为全球公共卫生危机，已成为人类亟需解决的问题[5]。

• • 1. 水环境中抗性基因的转移和扩散

研究抗性基因传播机制有助于认识其特性，了解抗性基因在环境中的迁移转移趋势，及评价抗性基因对人类环境影响等有着重要的意义。已有证据表明抗性基因可以在土壤和水体中迁移和转化，主要通过垂直转移和水平转移两种途径[6]。垂直转移指在细菌分裂复制中发生DNA突变，但这种概率很低，不能作为抗性基因传播的主要依据。

水平转移是抗性基因扩散传播的主要方式之一，包括接合作用、转化作用、转导作用[7]。抗性基因能够借助移动元件（整合子、转座子、质粒、噬菌体）进入微生物中，实现广泛的传播，微生物获得耐药性，更好的适应新环境。扬帆[8]等通过荧光定量PCR方法分析了四环素抗性基因及第一类整合子intll在污泥厌氧消化中的变化，结果发现四环素抗性基因中的tetG与intll基因之间具有显著正相关，表明质粒DNA结合作用对四环素抗性基因水平转移有促进作用。抗生素在环境中的迁移传播途径如图1-1所示[9]。

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