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硫化氢在活体的化学发光探针成像

硫化氢(H₂S)是人类健康和疾病的内源性介质，但在活细胞和动物中精确测量仍然是一个相当大的挑战。我们报道了三种1,2-二氧乙烷化学发光反应的全化学合成和表征探针ch -1, ch -2和ch -3。经H₂S处理后在生理pH值下，这些探针显示瞬时光发射，持续一个多小时，与其他活性硫、氧和氮物种相比具有高选择性。苯酚/酚平衡和原子电荷的分析为设计改进化学发光探针提供了一个普遍适用的预测模型。这些化学发光试剂的效用通过应用CHS-3检测使用多孔板阅读器的细胞生成的硫化氢，并利用CCD相机技术在活小鼠中成像硫化氢，证明了这些化学发光试剂的效用。

介绍

硫化氢(H₂S)作为哺乳动物生理和病理的重要中介，在血管舒张、血管生成、氧化还原调控、 神经调节、寿命、亨廷顿氏舞蹈症、唐氏综合症、糖尿病和癌症中发挥作用。在哺乳动物中，内源性H₂S由胱硫氨酸b-合成酶(CBS)、胱硫醚g-lyase (CSE)、3-巯基丙酮酸硫转移酶(3MST)产生。与一氧化氮(NO)和过氧化氢(H₂O₂)的活性表类似，,H₂S通过与生物分子的直接化学作用调节细胞功能，并可能根据浓度、组织定位和分子环境产生广泛不同的作用。例如,结肠癌中的H₂S通过刺激血管生成和支持细胞活力来促进肿瘤生长，而前列腺癌中的H₂S则能减缓细胞生长，干扰雄激素受体的转运，并通过抑制缺氧诱导的功能来减少血管生成因子1。考虑到H₂S的精细的位置和浓度依赖的作用，在活细胞和动物中进行精确的时空检测的简单方法是迫切需要的，并有望显著促进对这种反应性信号分子的理解。

H₂S的常用方法的检测，包括亚甲蓝法、离子选择性电极、安培传感器和气相色谱法，有不同的优点和缺点，但通常都不能检测完整的生物体内的H₂S。荧光探针提供靶向特定分析物的能力。最近，对H₂S反应的染料的开发出现了爆炸式的发展。不幸的是，内源性H₂S成像仍然很少见，而且需要先进的共聚焦显微镜装置，以实现精确的同细胞跟踪或双光子激发与比率成像。许多研究人员无法使用该仪器，从而减少了这些新开发工具的潜在影响。此外，H₂S在体内成像的例子也很少,而哺乳动物组织深层成像仍然是一个前沿领域。H₂S检测问题的核心是由于背景自动荧光、光散射、光活化/光漂白和需要长时间孵化来积累信号的探针动力学而导致的灵敏度和深度穿透的缺乏。为了解决这些技术挑战和工具的开发，更好地阐明H₂S的精确机制，在此，我们开发了一系列选择性和灵敏的化学发光探针用于在活的动物中的H₂S成像。

触发化学发光发射可以提供高度敏感的生物分析物读数。化学发光，不需要光激发，从而大幅度减少偶氮物官能团的自发光和光激活的背景。而生物发光(化学发光源自表达生物发光酶的生物系统，如荧光素酶)已被广泛应用于利用转基因生物进行临床前生物参数分析，小分子化学发光可用于野生型动物，并为临床成像提供了令人兴奋的机会。近年来，出现了一些用于体外检测H₂S的化学发光试剂。虽然很有希望，但对酶添加剂和碱性条件的需要引入了细胞毒性，并可能从蛋白质和其他碱性不稳定的硫池中释放硫化物，最终阻碍了他们在整个动物成像方面的潜力。

为了克服这些问题并扩大小分子生物分析的化学发光检测技术的范围，我们重点使用了空间稳定的1,2-二氧乙烷体系来开发一系列新的化学发光H₂S探针。空间稳定的二氧乙烷已被用于酶分析物的飞图检测并且已经证明了在体内成像的潜力。我们介绍了第一代化学发光的H₂S探针CHS-1、CHS-2和CHS-3，来源于空间稳定的螺烷1,2-二氧六烷支架，以自燃的4-叠氮苄基碳酸盐作为硫化氢的应位点(方案一)。本文报道了它们的合成、光学响应及对氢的选择性，其化学发光反应的实验和计算机制研究，我们使用了一个多孔板阅读器检测细胞的H₂S，以及整个动物的硫化氢化学发光成像演示。

结果和讨论

CHS-1、CHS-2和CHS-3的设计和合成

CHS探针系列的设计使得化学发光发射将由H₂S介导的偶氮化物基还原启动，然后自焚碳酸盐裂解，产生含有1,2-二氧乙烷的游离酚酸盐(方案1).带负电荷的酚类化合物通过分子内化学启动电子交换发光(CIEEL)机制在分解时自发发光。这种新产生的光可以直接观察到，或者通过将其能量转移到受体分子，如量子点、罗丹明。在我们的研究中，我们采用了一种市售的Emerald II增强剂溶液，该溶液由阳离子聚合物和一种光物理性质类似于荧光素的染料组成。该聚合物通过为化学发光反应提供一个疏水环境来减少水诱导的淬灭，染料有效地红色发光发射使其更适合于生物成像应用。

通过采用文献方法，我们优化了一种高效、模块化的合成路线来获得探针CHS-1、CHS-2和CHS-3(方案2)。首先，在对甲苯磺酸存在下，未取代的和氯化的3-甲氧基苯甲醛衍生物1a-c与正甲酸三甲基反应，得到乙酰2a-c。在0℃条件下，用亚磷酸三乙酯和三氟化硼合成甲氧基(3-甲氧苯基)甲基膦酸二乙酯3a-c。以3a-c膦酸盐为原料，经Horner-Wadsworth-Emmons反应得到4a-c烯醇醚 nBuLi和2-ada- mantanone.使用乙醇-萘酸钠进行亲核去甲基化提供了酚5a-c。根据类似的文献程序制备活化的酯6与酚偶联，以向1、2二氧乙烷提供7个含氮的前体。最后，通过单线态氧的溶液和可见光照射的敏化剂完成环加成，提供化学发光探针CHS-1，CHS-2和CHS-3。

响应和选择性

在三种CHS探针的基础上，我们继续使用日立F-7000分光光度计来测量它们对硫化氢的发光响应。。pH为7.4时，对CHS探针进行H₂S导致瞬时发光，在10分钟内以剂量依赖的方式增加(图1)。添加荧光素为基础的Emerald II增强剂提供了一个以545纳米为中心的红石峰，而酚的470 nm发射(图1，插图)。在这些生理相关条件下，我们观察到对H₂S的综合发光响应增加从CHS-1到CHS-2到CHS-3，分别为5倍、4倍和12倍的激活反应。需要注意的是，没有进行背景校正，图1中的值是直接仪器值，可以提供探针之间的准确比较。在pH值为10时，CHS-1具有最高的化学发光强度和响应，增加200分钟硫化氢的前10分钟光子发射增加0倍(图S1)。在碱性条件下，纯化的CHS-2和氯化的CHS-3触发的化学发光排放低于CHS-1。背景信号随着CHS-2和CHS-3的增加而增加，相对控制增加分别减少到2倍和3倍。这些探针的一个关键优点是，它们显示了即时浓度依赖的光发射，持续一个多小时(图S2dagger;)，这是在生物环境中产生的硫化氢的高通量检测和成像的理想特性。

接下来，我们测试了CHS-1、CHS-2和CHS-3对其他生物相关的活性硫、氧和氮(RSON)物种的选择性。通过加入5mm的还原谷胱甘肽(GSH)、1mm的L-半胱氨酸和同型半胱氨酸，以及200m的亚硝基谷胱甘肽、)、过氧化氢（H₂O₂）、次氯酸酸(HOCl)、过氧化氢、硝基氮（次硝酸）、硝氧化氮(NO)和亚硝酸盐(NO₂)来测试缓冲到pH7.4的20mmHEPES硫化钠对200mM的反应。没有一个测试的物种显示信号亮度强度不能增加空白控制(图。2a)。此外，对硫化钠的反应很少受到GSH、L-半胱氨酸和同型半胱氨酸的生理水平的影响。在pH7.4评估CHS-2和CHS-3在20毫米HEPES中的选择性时观察到相似的结果（图）。2b和c）。这些反应和选择性数据表明，CHS-1、CHS-2和CHS-3能够在生理相关的pH上检测到硫化氢，而来自竞争分析物的干扰最小。

化学发光硫化氢检测的力学研究

接下来，我们试图了解导致1,2-二氧乙烷化学发光探针增加光产生和优化响应的因素。首先，我们研究了苯酚/酚酸盐平衡的作用。由于CHS探针的酚酸二氧二烷产物的pKa的测量因其快速化学发光分解而变得复杂，我们使用报道的苯酚、2-氯酚和2-氯酚的实验值作为近似。47我们绘制了响应pH7.4和pH10处200毫米硫化钠的CHS-1、CHS-2和CHS-3的综合化学发光发射（图）。反对苯酚、2-鸟绿酚和2-氯绿酚的实验pKa值。3c和d）。在pH7.4下，H2S刺激的发射强度随着苯酚酸度的增加而呈上升趋势，这表明苯酚在这些条件下的电离对于获得良好的发光响应至关重要（图3c)。另一方面，它与苯酚pKa和在pH10处的化学发光反应并没有明显的相关性。3d)。我们通过对CHS-1、CHS-2和CHS-3a与硫化钠的反应中释放的酚酸盐结构进行量子化学计算，进一步研究了化学发光发射的性质(表S1-S3)。利用密度泛函理论在B3LYP/6-311G(d、p)的理论水平上进行了几何优化，每个原子上的电荷为

使用在M06/6-311G（d、p）理论水平上的静电势(ESP)模型进行计算。所有的计算都采用积分方程形式可极化连续体模型(IEF-PCM)作为高斯09程序包。虽然我们发现酚醛氧上的电荷与pH7.4处的化学发光反应之间没有相关性（图）。，与pH10处的反应有显著的相关性（R2gt;0.99）。3f)。用B3LYP和uB97XD泛函进行的ESP电荷计算也提供了O8电荷的良好相关性（R2gt;0.97）和pH10处的化学发光响应（图）。S3dagger;)。这些数据表明，在较低的pH下，化学发光发射是由质子化苯酚和非质子化苯酚酸氧之间的平衡控制的，并与之前的观察结果一致。CHS-3是最容易电离的，因此显示出最高的化学发光发射。另一方面，在pH10，酚酸盐在三种脱保护的二氧烷中占主导地位，化学发光发射效率通过负O8电荷密度来预测，可能是由于CIEEL开始第一分子内电子转移步骤的倾向增加。这些数据揭示了这些趋势，即为改进的化学发光试剂的设计提供了一个强大的预测模型。

利用CHS-3检测细胞H₂S

我们的结果表明，与CHS-1和CHS-2相比，CHS-3在生理pH上提供了最稳健的光发射。因此，我们检查了CHS-3检测人类肺腺癌上皮细胞（A549）中细胞硫化氢产生的能力。这些细胞表达半胱氨酸g裂解酶(CSE)，它可以利用同型半胱氨酸作为产生硫化氢的底物。我们首先展示了CHS-3以多井板阅读器格式检测外源性硫化钠的能力（图）。，并确定5.4mm的估计检测极限（空白控制3S.D.）。然后我们用CSE酶的底物HCy培养A549细胞。这就导致了与车辆处理的电池相比，CHS-3的发光发射的10%增加（对frac14;12，对frac14;0.044）。4b)。在加入CSE抑制剂D、L-丙原醇甘氨酸(PAG)预培养之前，应添加从CHS-3观察到的衰减信号。虽然观察到的增加很小，但在统计上表明不能检测整个细胞在生理pH上产生的硫化氢的有效性是为活体动物硫化氢成像奠定基础的重要进展。

使用CHS-3的H₂S的体内成像

接下来，我们研究了CHS-3使用IVIS光谱在生理pH上成像硫化氢的能力。不透明的井板在20毫米HEPES缓冲区中装载0、25、50、100和200毫米硫化钠，其中含有20%翡翠II增强剂。在40mm时加入CHS-3，并成像，显示发光强度随着硫化氢浓度的增加而明显增加（图）。5a)。当暴露在硫化氢下拍摄30秒时，重复实验的平均值在0-200毫米的范围内提供了良好的线性响应（图）。5b)。接下来，我们应用一个小鼠尸体模型来确定CHS-3是否有足够的光输出，可以通过哺乳动物组织观察到。给SCID/BALB-C小鼠的尸体注射了CHS-3和车辆对照组（图）。或0.4mmol硫化氢（图）。进入腹腔。与注射硫化氢的尸体相比，尸体的腹膜亮度明显增加。

CHS-3的光能够表明组织不能穿透，我们试图建立CHS-3在活体动物中成像硫化氢的能力。给予C6棕色小鼠注射。在他们的腹腔的一侧进行注射。在注射过程中抬高皮肤，以避免刺穿内脏。在含有20%翡翠II增强器的pH7.4缓冲的100mL HEPES中注入0.mmol硫化钠和0.4mmol硫化钠或车辆控制（水）。注射液中硫化钠的实际浓度为4米。而车辆控制实验则产生了适度的信号。接受硫化钠治疗的小鼠显示出强烈的光线，很容易通过组织检测到(图。5d)。来自复制实验的总光子的量子阳离子（图）。S5）显示硫化钠治疗小鼠与车辆对照组发光反应的4-倍增加（对frac14;3，对frac14;0.025）。5e)。药物耐受性很好，小鼠没有明显不适的迹象。综上所述，这些数据为开发一种研究生物硫化氢的新型体内成像工具提供了一个关键的里程碑。

结论

我们设计并合成了三种1,2-二氧乙烷化学发光反应2S探针，CHS-1, CHS-2，和CHS-3在在生理pH上与硫化氢反应时显示即时发光，这是硫化氢检测技术的一大进步。这些试剂利用分光光度计、多孔板读卡器和IVIS光谱仪为硫化氢提供了一个灵敏度和选择性的检测平台。我们提供了一个计算和实验支持的机械框架，作为一个预测模型来设计空间阻碍1,2-二氧乙烷与改进的光发射基于苯酚释放与硫化氢和这些结构的相对原子电荷密度。最后，我们证明了CHS-3不仅能够检测到在中性pH下用同型半胱氨酸处理的细胞产生的细胞硫化氢，而且具有在活体动物中成像硫化氢的罕见能力。虽然CHS-3为体内化学发

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