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氧化魔芋/羧甲基壳聚糖/氧化石墨烯水凝胶的制备及性能研究

摘要

多糖水凝胶已广泛用作生物医学领域的生物材料。在本文中，通过氧化魔芋葡甘露聚糖（OKGM）的醛基和羧甲基壳聚糖（CMCS）的氨基之间的席夫碱反应制备复合水凝胶。同时，添加不同量的氧化石墨烯（GO）作为纳米添加剂。水凝胶的特征方法采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和表面形态扫描电镜（SEM）。

通过SEM的观察，水凝胶的支架在冻干后呈现均匀的互连孔结构。此外，研究了不同GO含量对包括凝胶化时间，溶胀能力，水蒸发速率和机械性能的性质的影响。结果表明，水凝胶具有短的胶凝时间，适当的溶胀能力和水蒸发速率。特别地，当GO含量从0增加到5mg/ml时，抗压强度和模量分别增加144％和296％。此外，在应用MTT测定来评价水凝胶的生物相容性中，结果表明具有GO的水凝胶显示更好的生物相容性。由于有一定的吸水能力，与软组织相似的压缩模量和优异的生物相容性，复合水凝胶具有潜在的性能可应用于伤口敷料的制备。

1 绪论

皮肤是保护内部器官免受外部环境和防止身体脱水的重要的天然屏障，并且在损伤后它将失去其保护机制。因此，在伤口发生之后的完整屏障是至关重要的。近年来，由于水凝胶其独特的性质，包括生物相容性，生物可降解性，无毒性，作为一类重要的生物材料在药物和生物医学领域具有广泛的应用。水凝胶能给伤口维持潮湿环境，促进伤口的愈合。它的高含水量以及吸收大量体液的溶胀能力也促进了产生鼓励快速肉芽组织形成和再上皮化的潮湿环境。此外，水凝胶在结构上类似于天然细胞外基质（ECM），它们可以提供用于细胞粘附，增殖，细胞因子，营养物和代谢废物的运输的三维结构。因此，水凝胶非常适合用于伤口敷料。天然聚合物具有与天然细胞外基质（ECM）相似的组分，并且广泛用于生物医学应用。壳聚糖及其衍生物是最常用的生物材料之一。壳聚糖（CS）由通过beta;-（1-4）键连接的N-乙酰基-D-葡萄糖胺和D-葡糖胺单元组成。它一直被用作伤口愈合促进剂。然而，它由于其水溶性差的影响，很大程度上限制了其应用。作为改性壳聚糖的一种，羧甲基化壳聚糖（CMCS）是一种重要的水溶性壳聚糖衍生物，其表现为低毒性，良好的生物降解性以及生物相容性，在血液中的稳定性和良好的形成膜的能力。因此，CMCS已广泛用于许多生物医学材料，例如保湿剂，杀菌剂，伤口敷料，人造组织，血液抗凝剂和药物递送基质。此外，CMCS能够刺激成纤维细胞的细胞外溶菌酶活性，促进正常皮肤成纤维细胞的增殖和抑制斑痕成纤维细胞的增殖。

有许多关于CMCS交联以形成水凝胶的报道，其中通常涉及小分子交联剂，但它们具有潜在细胞毒性。魔芋葡甘露聚糖（KGM）是一种天然多糖，由D-甘露糖和D-（1,4）键连接的D-葡萄糖单元组成。作为beta;-(1,4)连接的多糖，KGM可以通过与高碘酸钠反应产生OKGM而被氧化。通过氧化反应，KGM分子链中的顺式二醇基团的C-C键被切割并生产含醛基官能团，其可以通过CMCS的游离氨基之间的席夫碱反应与CMCS的醛基化学交联。常规水凝胶由天然或合成聚合物组成，通常表现出相对差的机械性能，这限制了它们作为敷料的实际应用。为了解决这个问题，研究人员特别关注氧化石墨烯，石墨烯是氧化石墨烯的前体，由化学转化而来，其由二维片材组成并且在基面上具有大量含氧基团，例如羟基，环氧化物和羧基和边缘。这些含氧基团赋予GO片材具有与聚合物的强相互作用的功能，以形成GO插层或剥离的复合材料。同时，这种性质使得GO也可以容易地与聚合物共同形成以增强水凝胶的机械性能。此外，研究表明，石墨烯和氧化石墨烯具有支持细胞增殖，粘附和分化的能力，具有很少可以忽略不计的细胞毒性。此外，据报道，GO显示促血管生成性质，其可促进伤口愈合。因此，我们考虑将氧化石墨烯加入CMCS/OKGM水凝胶中以改善机械性质和生物相容性。

在本文中，我们准备了CMCS/OKGM/GO复合水凝胶，通过FT-IR和SEM测验。并研究了不同GO含量对凝胶化时间，溶胀能力，水分蒸发速率和机械性能等性能的影响。此外，通过甲基噻唑基四唑（MTT）测定评估生物相容性。由于它们的仿生组合物和绿色生产工艺，所述复合水凝胶预期具有作为伤口敷料的潜在应用。

2 实验

2.1材料

魔芋葡甘露聚糖（葡甘聚糖的含量如上）购自湖北强森魔芋有限公司（中国湖北武汉）。壳聚糖（脱乙酰度为92%）购自浙江玉环海洋生物化工有限公司（中国）。石墨粉购自阿拉丁。本文所用的一氯乙酸，氢氧化钠，高碘酸钠，乙二醇，高锰酸钾，五氧化二磷，硝酸钠，30％wt H₂O₂和其他试剂均为分析纯，无需进一步纯化，购自国药集团化学试剂有限公司.

2.2羧甲基壳聚糖

CMCS根据我们以前的研究制备方法稍作修改。将壳聚糖（6g）加入质量分数为50％NaOH溶液中，将混合物在-20℃下保持24小时。然后将解冻的壳聚糖分散在异丙醇中，加入一氯乙酸（9g）。将混合物在室温下充分搅拌。 然后将混合物加热至60℃保持5小时。将反应产物通过8000-10000分子量截留透析管对蒸馏水渗析3天，并在50℃真空干燥以获得纯化的CMCS，并将干燥的样品储存在真空干燥器中用于进一步使用。该反应如方案1所示。

2.3氧化魔芋（OKGM）

OKGM的制备根据以前的研究制备方法稍作修改。魔芋葡甘露聚糖用高碘酸钠氧化。在600ml 1％（w/v）KGM的水分散体中加入1.58g高碘酸钠，将混合物在30℃下在黑暗中充分搅拌12小时。然后将10ml乙二醇加入到反应混合物中以还原未反应的高碘酸盐并再搅拌2小时。将反应产物用蒸馏水透析3天，直到透析液不含碘酸盐（用硝酸银检查）。然后将反应产物在3000rpm离心20分钟。将上清液在50℃真空干燥，得到纯化的OKGM，将干燥的样品储存在真空干燥器中备用。该反应方法如方案2中所示。

2.4氧化石墨烯的合成

GO通过改进的Hummers方法用石墨粉进行制备。将石墨粉（2g），K₂S₂O₈（1g），P₂O₅（1g）放入烧瓶中，将浓H₂SO₄（20ml）加入烧瓶中以预氧化石墨粉末。将混合物在80℃剧烈搅拌5小时。然后将混合物在6小时内缓慢冷却至室温。将混合物过滤并洗涤直至滤液呈中性。然后将滤饼在50℃下干燥过滤。将预氧化石墨粉（2g），NaNO₃（2g）和H₂SO₄（100ml）放入在冰浴烧瓶中搅拌。同时缓慢地分批加入KMnO₄（6g）以保持反应温度低于10℃。搅拌30分钟后，将混合物转移至油浴中，在35℃下进一步搅拌5小时，然后将混合物用蒸馏水（500ml）稀释，然后逐渐加入15mlH₂O₂（30％wt）以终止反应。该产物用稀盐酸（1:10体积）洗涤。在8000rpm离心10分钟后，洗涤沉淀直至上清液为中性。然后将产物分散在蒸馏水中并在100W下超声处理3小时，然后将分散体对蒸馏水透析3d。将分散体冷冻干燥，得到纯化的GO。

方案一 羧甲基壳聚糖的制备

方案二 氧化魔芋的合成

2.5 OKGM/CMCS/GO的制备

将一定量的CMCS和OKGM加入到蒸馏水中，在室温下连续磁力搅拌，直至溶解至终浓度分别为5 wt％。然后将溶液在4℃储存备用。将不同量的干燥GO加入OKGM溶液（5 wt％）中至终浓度为0mg/ml，1mg/ml，3mg/ml，5mg/ml。以此方式，获得四种GO/OKGM溶液用于制备复合水凝胶。将不同的OKGM/GO溶液（2ml）分别与CMCS溶液（2ml）混合。然后使用Corning model PC-320热板/搅拌器在155rpm下搅拌混合物15秒，以确保氧化石墨烯均匀分布在混合物中，然后在4℃下保持24小时。根据GO的量，水凝胶样品分别编码为GO-0，GO-1，GO-3，GO-5。合成水凝胶的方法如方案3所示。

2.6 凝胶时间测试

凝胶时间试验按照以前报道的方法进行。将CMCS和OKGM/GO溶液的混合物置于培养皿（100times;20mmz，International VWR，中国上海）和磁力搅拌棒（Teflon氟碳树脂，5times;2mmz，Fisher Scientific，中国）放置在溶液液滴的中心。使用Corning model PC-320热板/搅拌器在155rpm下搅拌溶液。当溶液形成从盘的底部完全分离的固体小球时，记录凝胶化时间。使用重复三次测量计算来自每个样品的数据。

2.7 溶胀性能测试

将水凝胶样品（柱状，直径20mm和高度10mm）置于50℃的真空中并干燥至恒重。然后将样品浸入pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中并在室温下保持48小时。用滤纸吸收溶胀的凝胶表面上过量的液体。然后测量水凝胶的重量。

2.8水分蒸发率

将获得的新鲜水凝胶样品（柱，直径20mm和高度10mm）浸泡室温的蒸馏水中，直到达到溶胀平衡。然后取出样品并称重。将样品置于50℃和50％相对湿度的培养箱中24小时。以规定的间隔测量样品的重量，直到其变得恒定。

2.9凝胶机械性能

通过使用通常的测试仪器测量它们的压缩强度和它们的压缩模量来确定水凝胶的机械性能。 为了制备用于测定的样品，使用模具将水凝胶成形为直径为20mm和厚度为10mm的圆柱。 使用5KN测力传感器在10mm/min的应变速率下对圆柱形样品进行单轴压缩试验，施加载荷直至样品完全破碎。从应力—应变曲线的初始衬垫区域（0.10-0.20应变）计算压缩模量。重复三次测量计算来自每个样品的数据。

2.10 表征

使用JEOL JEM-2100E（日本）透射电子显微镜进行GO的透射电子显微镜（TEM）分析。将制备的样品配置成稀释的GO水溶液滴放在TEM网格上。将铜格栅冷冻干燥并在200kV的加速电压下观察。使用RENISHAW INVIA拉曼光谱仪在室温下用532nm的激发激光源进行GO的光谱分析。记录光谱从300至3300cm^-1。CS，KGM，CMCS，OKGM，GO和水凝胶样品的FT-IR光谱用Nicolet 170SX傅里叶变换红外分光光度计（美国）以400至4000cm ^-1的波数记录。所有测试样品通过KBr盘法的要求进行制备。扫描电子显微镜（SEM）图像用扫描电子显微镜（JEOL JSM-5610，Japan）拍摄。将水凝胶冷冻干燥以制备SEM样品。用金层涂覆试验样品，然后在25KV的加速电压下进行试验。

2.11细胞培养与样品制备

使用添加有10％胎牛血清（FBS）和含有100U/ml青霉素，100mu;g/ml链霉素的抗生素的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，高葡萄糖，HyClone）培养NIH-3T3小鼠胚胎细胞。将细胞在37℃下在含有5Ti CO₂的潮湿气氛中孵育，并且每2-3天更新培养基。用0.25％胰蛋白酶分离指数生长的细胞，然后重新移植到新鲜培养基中以产生用于进一步接种的新细胞悬浮液。

为了制备用于细胞毒性测定的样品，将材料全部灭菌并且所有操作在无菌条件下进行。使用模具将水凝胶成形为直径为10mm和2mm厚的圆柱。将盘在洁净台中在每个表面上暴露于紫外光（70mu;w/ cm ²）2小时以确保进一步使用的无菌性。

2.12 细胞毒性测定

使用如前所述的洗脱方法进行间接细胞毒性测定。简而言之，将NIH-3T3细胞以5000个细胞/孔的密度接种（以五次重复）于96孔培养板中，并孵育24小时以实现细胞的附着。同时，将灭菌的水凝胶样品转移到含有细胞培养基的24孔组织培养板中，并在含有5％CO₂的潮湿气氛中在37℃保持24小时。然后除去细胞板中的培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞两次。将水凝胶样品的提取洗脱溶液（200mu;l）加入每个孔中。分别孵育1d，3d，5d后，向每个孔中加入20mu;lMTT溶液（PBS中5mg/ml），将板在37℃下再培养4小时。然后除去细胞板中的培养基，向每个孔中加入一定量的二甲基亚砜（DMSO），随后将板振荡10分钟。使用酶标仪测量490nm处的光密度（OD）。将细胞在没有水凝胶样品的提取洗脱溶液作为阳性对照组的情况下培养，并且孔仅含有DMSO作为空白对照组。

3 结果与讨论

3.1 GO的表征

GO粉末的FTIR光谱如图1所示。GO的FTIR光谱在3399cm^-1,1731cm^-1,1623cm^-1,1400cm^-1和1052cm^-1处显示出特征带，这归因于OH伸缩振动，C=O伸缩振动羧基，sp²网络的C=C伸缩模式，C-OH基团的OH变形和COC伸缩振动。原始GO的TEM图像示于图1中。如图2（a）所示。可以看出，GO包含几个石墨层，其中一些折叠以诱导皱纹。皱纹对于防止在干燥过程中由范德华力引起的石墨烯的聚集是非常重要的。GO（1mg/ml）/OKGM（5％wt）溶液的数字照片示于图1.2（b）。GO片材在OKGM溶液中均匀分散，并且溶液稳定几个星期，没有发生沉淀或颜色变化。使用雷曼光谱法研究氧化过程中石墨的碳结构。图1中获得了GO的典型拉曼光谱。 G带和D带的特征峰分别为1590cm^-1和1350cm^-1。D和G带的强度比（ID / IG）为1.03，这与文献的GO值相似。这些表征证实氧化石墨烯已经成功制备。

3.2凝胶时间

进行凝胶时间试验

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