论文总字数：25327字

摘 要

莲生物碱具有显著的降血脂、抗癌、抑菌、抗病毒等药理活性。目前，基于转录因子的基因工程育种是农作物品种改良的一种最直接、最有效的手段。WRKY转录因子家族是高等植物中最大的转录因子家族之一，其家族成员及功能在众多的陆生模式植物中已有广泛的鉴定和研究，但在一些非模式植物如水生植物中WRKY的功能仍未可知。前期的比较转录组分析表明，NnWRKY40是调节莲生物碱合成的关键候选基因，本研究拟对NnWRKY40基因的具体功能进行进一步鉴定。

首先，利用生物信息学方法对NnWRKY40蛋白序列进行进化分析和保守域分析，发现三个NnWRKY40转录因子均比较保守，在进化树中与拟南芥AtWRKY40聚在一起。其次，利用半定量PCR对NnWRKY40在莲的根、茎、叶三种组织中的表达特性进行了检测。结果表明NnWRKY40a在莲的根和茎中表达，叶中不表达；NnWRKY40b在三种组织中均有表达；而NnWRKY40c在三种组织中均不表达。最后，利用双荧光素酶报告基因实验对NnWRKY40b的转录激活功能进行了检测，发现NnWRKY40b可以激活NnTYDC、NnCYP80G和Nn7OMT三个莲生物碱合成基因的启动子。

总之， WRKY40转录因子的序列和结构域在拟南芥和莲中是保守的，莲NnWRKY40转录因子能通过转录激活莲生物碱合成基因来促进莲生物碱的合成。本研究为今后基于NnWRKY40转录因子提高莲生物碱等次生代谢物的产量提供了基因资源，具有重要的现实意义和应用价值。

关键词：NnWRKY40；转录激活；双荧光素酶；植物双元表达载体

Abstract

Lotus alkaloids have significant pharmacological effects such as anti-atherosclerosis, anti-cancer, anti-bacteria, and anti-virus. At present, genetic engineering based on transcription factors is one of the most efficient way for crop cultivar improvement. The family of WRKY transcription factors is one of the biggest TF families in higher plants, which has been widely studied in many terrestrial model plants, but its functions in some non-model plants, such as aquatic plants, is still unknown. Previous comparative transcriptomic studies indicated that NnWRKY40 was a key candidate gene in regulation of alkaloid synthesis in lotus, thus in this study we aimed to do further functional study on it.

At first, phytogenetic and conserved domains analysis of NnWRKY40s were performed. Results showed that the three NnWRKY40 TFs had conserved WRKY domains and amino acid sequences along with Arabidopsis WRKY40. Secondly, semi-quantitative PCR experiment was carried out to check the tissue-specific expressions of NnWRKY40s. We found that NnWRKY40a was expressed both in roots and stems, but not in leaves; NnWRKY40b was expressed in all three tissus; while NnWRKY40c was not expressed in any of the three tissues. Finally, dual luciferase report assay was carried out to test the activation ability of NnWRKY40b on lotus alkaloid biosynthetic genes. Results showed that NnWRKY40b can activate the promoters of three lotus alkaloid structural genes: NnTYDC, NnCYP80G and Nn7OMT.

In summary, we found that both WRKY domains and amino acid sequences of WRKY40 were conserved in lotus and Arabidopsis, and NnWRKY40b can activate the expressions of lotus alkaloid biosynthetic genes. This study supplied valuable gene recourses for the breeding of high alkaloid lotus cultivars based on NnWRKY40 gene transformation, which is important for the development of lotus alkaloid production.

Key Words: NnWRKY40; Transcriptional activation; Double luciferase; Plant binary expression vector.

目 录

第1章 绪论 1

1.1 WRKY转录因子概述 1

1.2 WRKY转录因子功能简介 1

1.2.1 WRKY转录因子调控植物抗生物胁迫过程 1

1.2.2 WRKY转录因子调控植物抗非生物胁迫过程 2

1.2.3 WRKY转录因子调控植物次生代谢 2

1.3 WRKY调控水生植物莲生物碱合成的分子机制尚未被揭示 2

1.3.1 莲及生物碱的概述 2

1.3.2 NnWRKY40转录因子与生物碱合成 3

1.4 研究内容及技术路线 3

1.5 研究意义 3

第2章 材料和方法 5

2.1 材料 5

2.1.1 植物材料 5

2.1.2 实验所需细胞和载体 5

2.1.3 试剂 5

2.1.4 仪器 6

2.2 实验方法 6

2.2.1 DNA序列比对 6

2.2.2 NnWRKY40a、NnWRKY40b、NnWRKY40c基因结构及保守域分析 6

2.2.3 系统进化树的构建 7

2.2.4 莲总RNA的提取 7

2.2.5 反转录合成cDNA 7

2.2.6 半定量PCR及凝胶电泳 8

2.2.7 植物双元转化载体构建 9

2.2.8转录激活功能验证 12

第3章 实验结果 14

3.1NnWRKY40a、NnWRKY40b和NnWRKY40c基因的同源序列比对 14

3.2 NnWRKY40a、NnWRKY40b、NnWRKY40c蛋白保守基序分析 15

3.3 拟南芥中WRKY与莲WRKY40a、WRKY40b和WRKY40c蛋白序列聚类分析 15

3.4 NnWRKY40a、NnWRKY40b和NnWRKY40c基因在莲组织中的差异性表达 16

3.5 植物双元转化载体构建相关结果 17

3.5.1 NnWRKY40a、NnWRKY40b基因CDS序列扩增结果 17

3.5.2 大肠杆菌转化 18

3.5.3 菌落PCR 19

3.5.4双酶切验证重组质粒 19

3.6 NnWRKY40b蛋白转录激活功能验证 20

第4章 讨论与展望 22

4.1 讨论 22

4.1.1 NnWRKY40转录因子的结构和进化 22

4.1.2 NnWRKY40a、NnWRKY40b和NnWRKY40c基因在莲组织中的特异性表达 22

4.1.3 NnWRKY40b转录因子能显著激活生物碱合成酶基因的转录 22

4.1.4 技术问题 23

4.2 展望 23

参考文献 24

致 谢 27

第1章 绪论

1.1 WRKY转录因子概述

转录因子在调控基因表达中起到重要作用，在植物基因组中，有大量的基因编码转录因子，它们可以与靶基因启动子区的特定DNA元件相结合，控制下游相关基因的表达^[1]。Ishiguro等人从甘薯分离出植物中第一个WRKY转录因子^[2]，之后WRKY转录因子逐渐成为一个重要研究领域。WRKY转录因子具有一段高度保守的WRKYGQK核心序列并因此得名，以及特定的锌指结构。很多研究表明，WRKY转录因子不仅参与植物生长发育、物质代谢等重要生理活动，还调控植物对生物胁迫（病原微生物和植食性昆虫等）及非生物胁迫（干旱、高温、盐渍、氧化等）的应答反应^[3-5]。

1.2 WRKY转录因子功能简介

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