摘 要

本文通过查阅大量文献，综述了对中药提取的相关研究，总结了中药的活性成分及其生物作用，并以此为基础研究了中药甜瓜蒂中生物有效成分（多酚、黄酮、皂苷和多糖）的提取工艺，并结合细胞实验验证了提取物对胃癌细胞的抑制效果，同时评价了提取物对正常细胞的影响。所得结果对于进一步开发中草药，探寻最优的甜瓜蒂提取工艺和重新认识中药的生物活性具有重要的指导意义。

论文主要包括三个方面的研究内容。一是探索了不同目标产物所对应的最优提取条件。通过乙醇提取法，以提取时间、提取温度、料液比和溶剂的体积分数为单因素，探索了多酚、黄酮、多糖和皂苷分别对应的最佳提取条件。并对比了乙醇提取法和水提取法的差异。二是通过细胞实验验证了提取物对胃癌细胞的抑制作用。运用CCK8法，检测了添加甜瓜蒂提取物后胃癌细胞的增殖情况，讨论了甜瓜蒂提取物对胃癌细胞作用的量效关系，并计算了提取物对癌细胞的抑制率。三是评估了提取物对正常细胞的毒性，分析了正常细胞对毒性的响应特性。

研究结果表明：1.不同目标产物对应的最优提取条件是不同的。在甜瓜蒂中，多酚和黄酮对提取条件的响应是相似的，它们的最佳提取条件都处于较高的温度和溶剂浓度（80℃，80%-90%乙醇），以及相近的料液比（1/10-1/20）。不同的是时间，长时间的提取能够提高黄酮的产率（5h含量最高），但对多酚来讲并无益处（1h含量最高）。皂苷和多糖的结果相同，具有相同的最佳条件。而影响提取条件的可能因素为目标产物的理化性质差异。2.提取物对胃癌细胞和正常细胞均表现出了抑制作用，但结合细胞处理图像可以看出，提取物对正常细胞的抑制作用不同于胃癌细胞，这说明提取物对正常细胞的影响还有待探讨。

关键词：甜瓜蒂；提取；生物活性；抑癌作用

Abstract

In this paper, through consulting a large number of literatures, the relevant studies on the extraction of Chinese medicine were reviewed, and the active components of Chinese medicine and their biological effects were summarized. Based on this, the extraction process of biological active components from muskmelon base was studied (polyphenols, flavonoids, saponins and polysaccharides), and the inhibition effect of the extract on gastric cancer cells was verified by cell experiments, and the effect of the extract on normal cells was evaluated. The results have considerable guiding significance for the further development of Chinese herbal medicine, the search for the optimal extraction process of muskmelon base and the re-understanding of the biological activity of Chinese herbal medicine.

This paper mainly studied the content of three aspects. The first is to explore the optimal extraction conditions corresponding to different target products. The optimum extraction conditions of polyphenols, flavones, polysaccharides and saponins were studied by ethanol extraction method with the extraction time, extraction temperature, solid-liquid ratio and volume fraction of solvent as the single factors. The differences between ethanol extraction method and water extraction method were compared. The second is to verify the inhibitory effect of extracts on gastric cancer cells by cell experiments. CCK8 method was used to detect the proliferation of gastric cancer cells after the addition of melon root extract. The dose-effect relationship of muskmelon base extract on gastric cancer cells was discussed, and the inhibition rate of the extract on cancer cells was calculated. The toxicity of extracts to normal cells was evaluated and the response of normal cells to toxicity was analyzed.

The results show that: 1. The optimal extraction conditions corresponding to different target products are different. In the melon stalk, the response of polyphenols and flavonoids to the extraction conditions is similar, and their optimal extraction conditions are at a high temperature and solvent concentration (80℃, 80%-90% ethanol), and similar solid-liquid ratio (1/10-1/20). The difference is the time, the longtime extraction can improve the yield of flavonoids (the highest content is 5h), but it is not beneficial for polyphenols (the highest content is 1h). The results of saponins and polysaccharides are the same and have the same optimal conditions. The physical and chemical properties of the target products were the possible factors affecting the extraction conditions. 2. The extract showed inhibitory effect on both gastric cancer cells and normal cells. However, combined with the cell processing images, it could be seen that the inhibitory effect of the extract on normal cells was different from that of gastric cancer cells, indicating that the effect of the extract on normal cells remains to be explored.

Key Words：muskmelon base; extraction; biological activity; anticancer effect

目 录

第1章 绪论 1

1.1 甜瓜蒂 1

1.2 中药提取方法研究现状 2

1.2.1 提取方法 2

1.2.2 控制因素 2

1.2.3 参考条件 3

1.2.4 工艺优化 3

1.3 中药活性成分 4

1.3.1 多酚 4

1.3.2 黄酮 4

1.3.3 皂苷 4

1.3.4 多糖 5

1.4 小结 5

第2章 材料方法 6

2.1 实验仪器与试剂 6

2.1.1 实验仪器 6

2.1.2 实验试剂 6

2.2 实验材料 7

2.3 实验方法 8

2.3.1 甜瓜蒂药用成分的提取 8

2.3.2 药用成分的检测 8

2.3.3 细胞实验 8

2.3.4 数据分析 9

第3章 结果与讨论 10

3.1 单因素实验 10

3.1.1 乙醇体积分数 10

3.1.2 温度 11

3.1.3 时间 12

3.1.4 料液比 13

3.2 乙醇提取法和水提法的对比 14

3.3 生物活性检测 15

3.3.1 提取物对胃癌细胞生长形态的影响 15

3.3.2 甜瓜蒂提取物对胃癌细胞的抑制情况 16

3.3.3 提取物对胃癌细胞抑制的量效关系 17

第4章 结论 19

参考文献 20

致 谢 24

第1章 绪论

中药作为我国重要的医疗资源，有着不同于西药的良好疗效和治疗理念，近年来中医在世界上的影响越发深远，在其他国家越来越有竞争力^[1]。随着中医药产业国际化进程的推进，科学地认识中医药并拓展其潜在价值将成为改善中医药在国际市场中正常发展的保证^[2]。传统的中药在使用时，因其超标的重金属及对其他器官造成的毒害作用，使得服用中药成为了一大隐患^[3]。为了解决这一隐患，必要的提取工艺优化和活性、毒性检测就显得格外重要。传统的提取方法如煎煮、浸渍、压榨等方法技术相对成熟，随着新设备的研发，超临界流体萃取、超声提取法、微波提取法等工艺也经常使用^[4]。这些提取方法的提出将为降低中药毒性，提高中药疗效提供帮助。同时对提取物的生物活性检测也是十分有必要的。目前，已经发现的中药活性有抗炎^[5]，抗菌^[6]，抗肿瘤^[7]等，这些独特的疗效使得中药更具发展潜力。

甜瓜蒂是一种传统的中药材，目前对甜瓜蒂的研究相对较少。本文将以中药甜瓜蒂为材料，探索甜瓜蒂的提取方法，并对提取物进行活性检测。

1.1 甜瓜蒂

甜瓜蒂为甜瓜（Cucumis melo L.）的干燥果柄，在中医上具有催吐降逆，清热消肿，治疗湿热黄疸等功效^[8]。传统的使用方法为研末吹鼻和口服，这些寻常的使用方法会降低甜瓜蒂的利用率，所以有必要寻找合适的提取方法来提高甜瓜蒂的价值。目前对甜瓜蒂的提取主要是围绕葫芦素展开。冯淑萍以超声波提取法，探索了甜瓜蒂中葫芦素B的最优提取工艺，发现使用乙醇提取法的效果要优于甲醇^[9]。魏榕等人同样针对葫芦素，探索了不同提取条件对甜瓜蒂提取效率的影响，证明了无水乙醇具有更高的提取效率，同时发现甜瓜蒂纤维同样具有利用价值^[10]。这些对甜瓜蒂提取工艺的探索为提高甜瓜蒂利用率做出了很大的贡献，在一定程度上说明了使用乙醇为溶剂来提取甜瓜蒂的优越性，但他们都是针对甜瓜蒂中的主要有效成分而言的，对于甜瓜蒂中的其他成分却所知不多。甜瓜蒂中主要的活性成分为葫芦素，而葫芦素对癌细胞具有良好的抑制作用，能够抑制子宫颈癌和肝癌细胞的增殖^[11]。甜瓜蒂虽然不是一种名贵的药材，但能收获的产量却很少，所以探索甜瓜蒂中的其他成分可能会提高它的药用价值。然而针对甜瓜蒂中的其他成分以及这些成分对甜瓜蒂生物活性的影响仍知之甚少，需要进一步的探索。

1.2 中药提取方法研究现状

传统的中药在使用时一般采用煎煮内服和外敷的方法，这种使用方法虽然降低了药物的利用率，但同样降低了可能造成的毒性作用。所以随着中医在现代的发展更多的中药需要先进行提取，再制成制剂^[12]，同时满足了提高利用率和降低毒性的要求。

1.2.1 提取方法

目前针对中药有效成分的提取方法都是选择有机溶剂作为提取剂，比如甲醇、乙醇等，再辅以超声、微波等条件来实现高效率的提取。夏宇成等人研究了种子类药材菟丝子的提取工艺，结果发现捣碎醇提的方法更有利于菟丝子有效成分的溶出^[13]。王春驰等人采用先水煎，再用甲醇超声的方法探索了返魂草的提取工艺，以这种简单的方法建立了HPLC特征图谱^[14]。唐君毅等人结合响应面实验，以超声醇提的方法研究了刺五加籽中黄酮的提取工艺，结果发现50%乙醇浓度下超声20分钟效果最好^[15]。除了超声之外，微波辅助提取、超临界提取法等提取法也被广泛应用。梁燕妮等人采用微波辅助提取法研究了影响茶多酚提取效率的微波条件，结果发现60℃，功率900W，微波11分钟效果最好^[16]。超临界提取法在对挥发油、黄酮、皂苷等成分的提取上也有着良好的表现^[17]。这些方法都使目标产物能够与提取溶剂充分混合，从而达到提高产率的效果。但是无论是超声还是微波或是超临界流体萃取，它们对能源的消耗都不小，而且并不适合大规模的工厂生产。

1.2.2 控制因素

在对中药提取的研究过程中，多种因素影响着提取效率，比如提取温度、提取时间、料液比、提取剂的体积分数等。这些因素可能从多个方面影响着提取效率，包括产物对提取溶剂的耐受性，易被氧化，易分解等。在对丹参生物有效成分的提取实验中，升高温度会降低丹参酮的含量，但通过与植物药材配伍或包合可降低升温对活性成分造成的损失^[18]，这种配伍的方式对减少提取过程中照成的损失具有一定的参考价值。对于易分解和氧化的成分，参考中药保存的方法，应采取改变提取的条件或降低温度等方法来减少损失^[19]。所以，在探索中药最优提取方案的同时，控制不同的条件可能会实现更低碳高效的提取方法。

1.2.3 参考条件

中药中含有的成分是十分复杂的^[20]，不同的成分在生物体内发挥作用时可能存在着协同、促进或是抑制等功效。就传统中草药来讲，多种成分的共同作用才是其对某些症状的最终效果。所以很多研究者为了弄清楚其中的有效成分，针对性地以某种活性成分（多酚、黄酮、多糖、蛋白等）为参照展开了一系列研究。周秋艳等人以溶剂萃取法，探索了荔枝核中多酚的提取工艺，但荔枝核中的其他有效成分如黄酮、脂肪酸等物质并未被拓展研究^[21]。申梦娜等人探索了襄麦冬中黄酮的提取方法及生物活性，发现提取物具有抗氧化和抑菌的效果^[22]，但并未指出其他成分的影响。然而对于荔枝核中的黄酮和襄麦冬中的其他成分，这些没有被同时提出的物质可能同样具有特殊的治疗效果。所以，针对具有多种成分的中草药来说，从多个方面来考量提取工艺和生物活性更能解释它们的作用。比如，陈小强等人在探索用响应面法优化黄檗果实的提取工艺中就考量了多酚和黄酮两种成分^[23]，这同时关注多种成分的研究方法对于提高中药材的开发价值具有一定的启发性。

1.2.4 工艺优化

中药的提取工艺会随着目标产物的不同而产生差异，在对提取方案的探索过程中，越来越多的研究者开始从其他方面探索提取的最优条件。吴思佳等人以甘草中皂苷和黄酮两种成分为目标产物，利用遗传神经网络法优化了甘草的提取工艺，这种优化方法具有一定的可行性，并且对扩大优化工艺中的选择范围，从多个目标产物出发来评估工艺效果都有参考价值^[24]。于宗渊等人探索了Box-Behnken Design-响应面法(BBD)、遗传算法和直接搜索算法对北沙参糖类化合物提取方法的优化效果，结果发现BBD结合遗传算法和直接搜索算法效果更好，对于糖类化合物的提取优化具有参考价值^[25]。除了使用算法优化提取方案外，使用新式的提取方法也有着良好的效果。高建德等人利用复合酶辅助提取法，探索了肉苁蓉多糖的提取工艺，结果发现，复合酶的参与使得肉苁蓉多糖的提取率高于传统水提取法3.47%，加入复合酶对提高多糖提取率有巨大的帮助^[26]。所以，对于中药提取工艺无论是传统的探索还是现代化的优化，探索出最优的解决方法都是共同的目标，而中药这个巨大的宝库仍然存在着无数的秘密，值得更多的思想在这里碰撞。

1.3 中药活性成分

1.3.1 多酚

植物多酚即单宁类物质，有缩合单宁和水解单宁之分，具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒等^[27]。Theoduloz Cristina等人评估了智利红醋粟多酚对人胃上皮细胞中氧化应激的影响，发现多酚的存在能够促进抗氧化酶活性的增加，从而实现对细胞的保护作用^[28]。从D.innoxia中提取的多酚可能通过同时靶向DNA和组蛋白来影响细胞的增殖，从而可能对抑制癌细胞生长具有一定的作用^[29]。王玥等人通过将茶多酚与可降解成膜底物复合，不仅防止了食品被氧化，同时具有良好的抑菌效果^[30]。至于抗病毒，Maria Musarra-Pizzo等人通过抑菌实验和病毒级联抗原表达实验，证明了杏仁皮中的多酚不仅能够抑制金黄色葡萄球菌的生长还能对疱疹病毒产生抗性^[31]。而且多酚不仅具有一定的生物活性，而且它们的代谢物与母体同样有着相似或更高的生物活性^[32]。所以，作为一种具有广泛生物活性的物质，多酚的作用不容忽视。

1.3.2 黄酮

黄酮的生物活性与多酚有些相似，它对癌细胞具有一定的抑制作用，同样具有抗炎、抗氧化的特性^[33]。在抗癌方面，目前对黄酮的研究已经深入到靶向给药了，将黄酮加入到磷脂基Labrasol/Pluronic F68修饰纳米微球中，可实现黄酮的均匀靶向分布，可增强对大鼠神经胶质瘤的抑制作用，具有更好的抗肿瘤效果^[34]。蔡冬宝等人探索了不同提取溶剂对高钙菜提取物抗氧化能力的影响，结果发现乙酸乙酯的效果最好，而乙酸乙酯层对应的是黄酮醇，所以高钙菜黄酮可能具有良好的抗氧化活性^[35]。对于炎症，已有研究者探索出了黄酮对炎症反应作用的机制，Maleki等人综述了黄酮对炎症的响应机制，这可能涉及到黄酮对中枢激酶的抑制作用，以及对蛋白激酶抑制转录因子的调节作用^[36]。黄酮的多种生物活性说明了中草药起作用可能的多种可能，与同样存在与中草药中的多酚、皂苷、多糖等物质可能有着不同的相互作用。

1.3.3 皂苷

本文所探究的甜瓜蒂中主要的生物活性物质已被认为是葫芦素类成分，葫芦素是一种四环三萜化合物^[37]，了解皂苷类化合物将有助于发掘甜瓜蒂的利用价值。已报道的皂苷类化合物具有抑制肿瘤细胞增长、增强免疫力、调节脂类代谢等活性^[38]。ZHU Fu-rong等人研究了铁线莲皂苷对四种肿瘤细胞（食管癌细胞、口腔癌细胞、肝癌细胞和胃癌细胞）增殖的抑制作用，结果发现铁线莲皂苷能够抑制这四种肿瘤细胞的生长，且具有明显的细胞毒性^[39]。有研究报道称日本人参皂苷能够增强HepG2细胞的脂质代谢，降低HepG2细胞内的脂质积累，这种增强作用可能与皂苷对雌激素相关受体（ERβ）的作用有关^[40]。皂苷类成分的作用有利也有弊，但对癌细胞的抑制作用却是毋庸置疑的，这种作用也与葫芦素的特性具有一致性。

1.3.4 多糖

多糖是大多数中草药等植物中含量较高的化学成分，它们同样具有多种生物活性，如抗肿瘤、降血糖、抗病毒等^[41]。Ying Li等人对比了热水提取法、超声提取法和酶联提取法三种方法所得的Ecklonia kurome多糖对乳腺癌细胞生长的影响，结果发现通过三种方法得到的多糖均能抑制癌细胞的迁移并促使其凋亡，而且用热水提取的效果最好^[42]。除了抑癌效果外，从粗茶中提取到的多糖对血糖的降低也有一定帮助，而且比普通绿茶中提取得到的多糖效果好，不同提取方式也会影响提取所得多糖的效果，在对比了水提取法、超声提取法、微波提取法和酶提取法后，Jiangxiong Zhu等人发现酶提取法所得的多糖降血糖效果最好，这可能与酶对糖链的消化有关^[43]。多糖的抗病毒活性主要体现在对病毒复制周期的阻断上，Eiman Abu Gleon等人研究了天然多糖对疱疹病毒的抑制作用，结果发现所有的多糖对疱疹病毒均具有较高活性，但具体对病毒复制周期的阻滞机理仍需探索^[44]。

1.4 小结

中草药作为我国重要的医疗资源，同时也是有待探索的科学宝库，目前对于中草药的了解尚有不足，仍值得探索。而甜瓜蒂作为中草药中的一份子，而且对它的研究不多，所以本课题以甜瓜蒂为研究对象。为了寻求甜瓜蒂中不同生物活性成分的提取方法，本课题选择了多酚、黄酮、皂苷和多糖四种生物活性成分作为目标产物，它们在提取产物中的含量作为评判提取效果的依据。因为它们都有多种生物活性，而且在对癌细胞的抑制作用上表现出了一致性，这一特性或许会改变人们对于中药作用的认识。本文将以细胞实验探索甜瓜蒂提取物的生物活性，对于优化提取工艺和探索中药利用提供一定的参考。

第2章 材料方法

2.1 实验仪器与试剂

2.1.1 实验仪器

表2.1 仪器设备

2.1.2 实验试剂

表2.2 实验试剂

2.2 实验材料

（1）甜瓜蒂：经过干燥处理的甜瓜蒂由湖北省农科院提供。采自成熟甜瓜的瓜蒂部分，采收后置于恒温干燥箱中烘干至恒重。