摘 要

在养殖池塘系统中存在沉积物的总磷含量高水体活性磷含量低，磷的总体利用率不高的问题。本实验的目的是筛选高效解磷细菌，为促进池塘磷循环提供新的微生物资源。本研究利用稀释平板法从华中农业大学养殖池塘底泥中分离和纯化具有高效解磷能力的解磷细菌；结合菌落形态观察，通过16SrDNA序列分析对溶磷菌株进行鉴定；通过120h内的解磷量变化研究选定菌株对混合难溶磷的解磷能力；测定不同C源、N源、pH、温度和盐度对高效解磷菌株生长及溶磷的影响，确定菌株对盐度和pH的耐受性范围；研究菌株对不同磷源的解磷能力，并通过陶粒、碎石、煤渣固定化研究菌株实际解磷效果。取得以下研究结果：从池塘底泥中分离得到1株能高效解磷的细菌分离物NH11，通过形态观察和16S rDNA序列分析得出HN11属于约氏不动杆菌；研究得出菌株HN11最佳生长条件；在碳源为果糖、氮源为尿素、pH值为7.0、温度30℃和盐度为0.1%的条件下生长最好；120 h解磷量最高到达18.24 mg/L；3种不同材质对HN11均可提高水中活性磷含量，解磷效果最好的介质是煤渣。该菌具有较强的解磷能力，可成为生物活性磷肥的接种剂，结合其适应性强分布广泛的特点，有望在实践中发挥重要作用。

关键词：解磷菌，约氏不动杆菌，难溶性磷，解磷能力

Abstract

In the pond system, phosphorus mostly deposited in the sediment, and dissoluble phosphorus content in water is limited. Thus, the utilization of phosphorus in the shrimp ponds is low. The purpose of the study is to screen highly phosphate solubilizing bacteria (PSB), and provide new microbial resources for improving phosphorus cycle. The methods such as plate screening, isolation and purification were applied to screen high-efficiency phosphate-solubilizing isolated from sediments of ponds in Huazhong agriculture university. The isolates were identified by morphological characteristics and 16S rDNA sequencing. The insoluble phosphate solubilizing capacity of the isolates was tested in 120 h. The effects of different C sources, N sources, pH, temperature and salinity on the growth of the strains and the tolerance scope of isolates to salinity and pH were determined. After that, we measured the solubilizing capacity of the isolate to different phosphorus sources. Then we studied the practical solubilizing phosphorus effect of the isolate through immobilizing them with ceramic, gravel, cinder. The result showed that the selected isolate HN11 was identified as Acinetobacter johnsonii. The phosphate-solubilizing effect of HN11 reached the highest value under the condition of 30℃, pH 7, 0.1%salinity, urea (nitrogen) and fructose (carbon). The maximum phosphate-solubilization of HN11 was observed at 120 h, which was 18.24 mg/L. After the immobilization of the strain HN11 with three different materials, dissoluble phosphorus content in water was increased compared with the controls, and we found the best immobilized material is cinder. The strain HN11 can use as biologically inoculants to regulate the balance of phosphate. It was supposed that the isolates HN11 which characterized with high-efficiency phosphate-solubilizing ability and extensive distribution could be used for the development of bioremediation agents and may play an important role in bioremediation in aquatic environment.

Key words: phosphate solublizing bacteria, Acinetobacter johnsonii, insoluble phosphate, solubilizing phosphorus capability

目□□录

第1章 绪论 1

1.1 引言 1

1.2 磷在池塘养殖中的形态 1

1.3 解磷微生物概况 2

1.3.1 国内外解磷微生物的研究进展 2

1.3.2 解磷微生物种类及解磷差异 2

1.3.3 解磷微生物的分布特点 3

1.3.4 解磷微生物的分离筛选方法研究 3

1.3.5 解磷微生物的解磷机理 4

1.3.6 解磷微生物研究的意义 4

1.4 研究的内容与目的 4

第2章 材料与方法 6

2.1 仪器与试剂 6

2.1.1 仪器 6

2.1.2 其它实验用具 6

2.1.3 化学试剂 6

2.1.4 培养基与试剂制备 8

2.2 实验方法 8

2.2.1 样品的来源 9

2.2.2 样品处理 9

2.2.3 解磷菌的筛选纯化 9

2.2.4 解磷菌的鉴定 9

2.2.5 解磷菌的解磷能力研究 10

3.1 解磷菌的筛选纯化 12

3.1.1 平板初筛 12

3.1.2 纯化 12

3.1.3 测量解磷菌的菌落和溶磷圈直径 13

3.1.4 液体摇瓶复筛 14

3.2 解磷菌的鉴定 15

3.2.1 形态鉴定 15

3.2.2分子鉴定 16

3.3 解磷菌的解磷能力研究 17

3.3.1 解磷菌120h解磷量变化 17

3.3.2 不同碳源对解磷菌的解磷能力的影响 18

3.3.3 不同氮源对解磷菌的解磷能力的影响 19

3.3.4 不同pH对解磷菌的解磷能力的影响 19

3.3.5 不同温度对解磷菌的解磷能力的影响 20

3.3.6 不同盐度对解磷菌的解磷能力的影响 21

3.3.7 解磷菌对单一磷源的解磷能力研究 21

3.4 模拟池塘环境的解磷研究 22

第4章 讨论 23

第5章 结论 24

致 谢 26

第1章 绪论

1.1 引言

磷是池塘中水生生物的主要并且至关重要的营养素，也是水产养殖中限制初级生产力的关键元素之一^[1]，人们为了追求养殖产量的最大化，在生产过程中向池塘投入大量的含磷饲料和磷肥^[2]，但是最终的结果是池塘中总磷含量高，但活性磷含量低，因为大部分磷作为化学肥料应用于池塘养殖的可溶性无机磷酸盐会迅速固定化不能被植物所利用，造成了极大的浪费，利用率低并且还会污染池塘底泥^[3]。而且，由于磷不具有挥发性，沉积的难溶性磷在水底深处基本上没有返回陆地的有效途径，因此磷的循环为不完全的循环，磷在某种意义上是不可再生的资源，这将会严重影响到我国磷化工产业的可持续发展，如果将沉积物中的难溶性磷释放出来，转化为可被水生生物直接利用的活性磷，不仅可促进养殖池塘中水生生物的生长，还可在一定程度上节约成本，减轻污染，减少养殖池塘自身的环境负荷，进而提升养殖生产的经济效益和生态效益。所以如何提高磷的利用率成为当前研究的热点^[4]。

1.2 磷在池塘养殖中的形态

磷肥和含磷的饲料是养殖池塘生态系统中磷的主要来源，另外，还包括放养的水生生物、降雨、注水和其他途径的输入。因为磷很容易被氧化，所以自然界中磷没有单质形态，磷一般以磷酸盐的形式存在，如磷酸钙Ca₃(PO₄)₂、氟磷灰石3Ca₃(PO₄)₂·CaF₂。

磷在养殖池塘中从成分的角度来看可以分为两大类：有机磷和无机磷，无机磷包括磷酸钙、镁类化合物，磷酸铁、铝类化合物和闭蓄态磷，闭蓄态磷是指磷酸盐被铁铝化合物胶膜包裹后形成的难溶磷酸盐^[5]。而有机磷的形式比较多，其主要存在于动植物体内及其代谢产物中,主要形式为磷酯类、植酸、核酸和类磷酯类化合物^[5]。其中磷酸肌醇的的含量最高，将近占有机磷含量的一半。相比于无机磷而言，有机磷中大部分参与到磷循环中，因此有机磷流动性很强，固定化程度较低。按照能被养殖池塘中的水生生物的利用程度来划分，分为可溶性磷和难溶性磷两种，养殖池塘能直接利用的磷是可溶性磷，但是养殖池塘中的可溶性磷的含量极少从而不能满足水生生物养殖正常生长的需求。因此，需要施加大量的磷肥和含磷饲料等外源磷来进行补充。根据数据统计，我国磷化工产业迅速发展，生产磷化工产品的企业有500家以上，2014年全年生产磷肥1669.93万吨^[6]，但这背后隐藏着巨大的危机，这些磷肥施加到养殖池塘中去，大部分与池塘里的Ca² 、Fe³ 、A1³ 等离子结合形成难溶态的磷积累在池塘中去，造成了池塘里总磷含量丰富而水生生物可利用的有效磷不足的局面。

1.3 解磷微生物概况

1.3.1 国内外解磷微生物的研究进展

目前研究表明，通过解磷微生物是解决上述问题的最佳办法，早在1908年，Sackett就发现土壤中有些微生物可以分解难溶性的磷化合物^[7]。国外对解磷菌的具体研究最先开始于五十年代，当时苏联国营农场在推广菌肥时发现,磷细菌在增强土壤中其它有益微生物的活动的同时,不仅改善植物磷素营养,也显著地改善了植物根部营养，从此，磷细菌在苏联和东欧一些农业为主的国家受到很高的重视^[8]。

我国自古以来都是农业大国，因此新中国建立初期也开始进行解磷菌相关的研究工作，到70年代的时候便有多株解磷菌应用到实践生产上。到了80年代的时候，已经有许多公司开始了以不同组合的系列产品进行推广，极大地促进农业的可持续发展^[9]。尽管我国解磷菌起步较早，发展时间较长，但仍然存在着发展缓慢、应用不够普及等问题。目前对池塘底泥解磷菌的研究较少，高效解磷菌的解磷特性、影响解磷效果的因素及作用机制尚不明确，这给高效解磷菌应用于水产养殖带来了诸多不便。

1.3.2 解磷微生物种类及解磷差异

目前研究表明，解磷微生物的种类繁多，主要包括三大类：细菌、真菌和放线菌，其中细菌的种类最多，包括：不动杆菌属、微小杆菌属、欧文菌属、沙雷式菌属、假单孢菌属、红球菌属、金黄杆菌属、戈登氏菌属、叶杆菌属、克雷伯杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、固氮螺菌属、无色杆菌属、节杆菌、硫杆菌属气杆菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、杆菌属、泛菌属、黄杆菌属以及戴尔福特菌属等。其中解磷巨大芽胞杆菌是发现最早、解磷效果最好、使用国家多、推广面积大的菌株,它主要具有溶解磷酸三钙的能力^[5]。相比较而言，解磷真菌的种类较少，主要包括：青霉属、拟青霉属、分枝孢子霉属、曲霉属、镰刀菌属、顶套霉属和根霉属，另外,钟传青和黄为一证实酵母菌也具有一定的溶磷能力。最后放线菌中具有解磷能力的菌属有链霉菌属和小单孢菌属，但其中绝大部分为链霉菌属。

解磷微生物不同种类之间的解磷能力差异十分明显，能力强弱相差几倍，几十倍甚至几百倍。甚至是同一种类的不同解磷微生物解磷能力也存在较大差异。另外，解磷微生物的解磷特性在遗传的过程中可能存在丢失的现象。解磷微生物在不同的pH、盐度、氮源、碳源、温度等条件下解磷效果也不同，对不同种类的难溶性磷的解磷效果也是大不相同。

1.3.3 解磷微生物的分布特点

解磷微生物广泛存在于自然界中并具有明显的根际效应，但是在根际微生物中，解磷微生物并不是优势菌种。解磷微生物在不同环境中的数量存在一定差异。

林启美等人对农田、草地、菜地和林地中解磷微生物的种类及数量进行了研究,发现不同的土地利用类型之间主要的解磷微生物种类和数量差异较大,其中无机磷细菌的数量明显少于有机磷细菌,菜地的解磷细菌的种类与数量相比其它几种土地利用类型要多^[10]。