摘 要

丰富多样的结构赋予萜类化合物广泛的生物活性性，挖掘萜类合酶这个重要的萜类化合物生物合成元件对于丰富萜类化合物骨架多样性具有重要意义。课题组前期已对实验室分离得到的一株禾谷镰刀菌进行基因组测序及序列分析，从中挖掘了一个潜在的萜类合酶FgJ03982，但其生物学功能尚不为我们所知。为此，本课题从该菌基因组中克隆该基因并成功实现异源表达及纯化，得到高纯度FgJ03982蛋白。生物信息学分析可知其为非分泌蛋白，二级结构中α螺旋占比最大，通过同源建模，预测了三维结构，序列同源性为59%。这些工作为后续验证其生物学功能奠定基础。

关键词：萜类合酶；FgJ03982；异源表达；生物信息学分析

Abstract

Abundant and diverse structures give terpenoids a wide range of biological activities, and the discovery of terpenoid synthase, an important element for the biosynthesis of terpenoids, is of great significance for enriching the diversity of terpenoid skeletons. In the early stage, the research group has sequenced and analyzed the genome of a strain of Fusarium graminearum isolated in the laboratory, and excavated a potential terpenoid synthase FgJ03982, but its biological function is still unknown to us. Therefore, this project cloned the gene from the fungal genome and successfully achieved heterogenous expression and purification, obtaining high-purity FgJ03982 protein. Bioinformatics analysis showed that it was a non-secretory protein, with the largest proportion of alpha helix in the secondary structure. The three-dimensional structure was predicted by homology modeling, and the sequence homology was 59%. These works lay a foundation for the subsequent verification of its biological function.

Key Words：terpenoid synthase; FgJ03982; heterologous expression; bioinformatics analysis

目 录

第1章 绪论 1

1.1萜类化合物 1

1.1.1萜类化合物简介 1

1.1.2萜类化合物分类及应用 1

1.1.3萜类化合物生物合成途径 2

1.2 萜类化合物高效合成的研究现状 3

1.3 挖掘萜类合酶及新骨架萜类化合物的研究现状 4

1.4 研究内容与意义 5

1.4.1 研究内容 5

1.4.2 研究意义 6

第2章 实验材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1实验仪器 7

2.1.2实验试剂 7

2.2 实验方法 9

2.2.1 概述 9

2.2.2试剂配制 9

2.2.3 禾谷镰刀菌基因组总DNA的提取 11

2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的转化 12

2.2.5 所需基因片段的获取 12

2.2.6 T4酶连接构建载体 15

2.2.7 表达载体的验证 15

2.2.8大肠杆菌质粒DNA的提取 16

2.2.9 目的蛋白的分离纯化 17

2.2.10 FgJ03982蛋白序列的生物信息学分析 17

第3章 结果与讨论 19

3.1 质粒pGB154的构建 19

3.1.1 PCR扩增获得目的基因外显子 19

3.1.2 重叠延伸PCR拼接扩增完整目的基因编码区 20

3.1.3 酶切酶连构建质粒pGB154 20

3.2 FgJ03982蛋白表达纯化 21

3.3 FgJ03982蛋白序列的生物信息学分析 21

第4章 总结与展望 23

参考文献 24

附录 26

致谢 27

第1章 绪论

1.1萜类化合物

1.1.1萜类化合物简介

萜类化合物既是进化过程中最古老，也是数目最多的一类天然产物，与生物碱、黄酮类化合物共同组成植物次生代谢产物^[1]。萜类化合物种类丰富、结构复杂，迄今为止，从自然资源中分离鉴定的已知结构的萜类化合物超过5万种之多，广泛分布于细菌、高等植物、真菌、昆虫及其它真核生物中^[1,2]。萜类化合物是以若干个异戊二烯单元为骨架的化合物总称，因此也称为异戊二烯类化合物，极其丰富的骨架结构赋予了其广泛的功能和巨大的应用价值^[2，3]。

因此，解析已知萜类化合物生物合成途径、挖掘其生物合成元件、发掘新骨架萜类化合物等相关基础研究对于增加萜类化合物产量和拓展萜类化合物应用领域具有重要意义，社会和经济价值不言而喻。

1.1.2萜类化合物分类及应用

萜类化合物由自然界广泛存在的异戊二烯衍生物组成，分子式通式符合(C₅H₈)_n（n是异戊二烯单元的数目）。萜类化合物的命名取决于分子中异戊二烯结构及其碳原子的数量。根据异戊二烯单元数目不同，萜类化合物可分为单萜（n=2）、倍半萜（n=3）、二萜（n=4）、二倍半萜（n=5）、三萜（n=6）、四萜（n=8）及多萜（ngt;8）。这些萜类化合物种类繁多、数目庞大，而且分布十分广泛，具有重要的生物活性和应用价值^[3]。

生物及医学研究表明，众多萜类化合物具有广泛的抗癌功效。从红豆杉中提取分离出来的三环二萜化合物紫杉醇是目前疗效最为突出的天然抗肿瘤药物，对发病率较高的乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌等有无可比拟的显著疗效^[4]。研究人员从从薄孔菌属中的大型药用真菌牛樟芝中分离得到大量新颖的萜类化合物，这其中包括三种麦角甾烷三萜，进行细胞毒性实验发现，其中两种分别对直肠癌细胞和乳腺癌细胞的生长繁殖有抑制作用^[5]。金海峰等研究发现一种来源于姜科姜黄属植物温郁金的二萜类化合物可通过抑制NF-κB信号通路，上调凋亡执行蛋白 Caspase-3 的表达，达到抗肿瘤作用^[6]。来源于葫芦科的葫芦素B是一种三萜化合物，实验证实，葫芦素B对胰腺癌、肝癌和头颈部鳞癌等恶性肿瘤细胞的增殖具有抑制作用^[7,8]。

炎症是机体免疫系统最重要的生理反应之一，能促进机体清理致病因素。天然萜类化合物因毒副作用低，成为广受欢迎的抗炎药物^[9]。几个世纪以来，药用植物提取物一直被用来缓解炎症，大量萜类化合物存在于传统的植物性天然药物中。NF-κB信号通路是引起炎症反应非常关键的信号通路，NF-κB信号传导通路的几种强有力的抑制剂是天然萜类化合物，如欧苷菊倍半萜内酯和心菊内酯A^[9,11]。倍半萜类化合物是众所周知的NF-κB信号抑制剂，但二萜和三萜类化合物也含有几种NF-kB信号抑制剂，如：雷公藤甲素、东凌草素Oridonin、皂苷类化合物、羽扇豆醇等，这些萜类化合物通过抑制NF-κB复合物与DNA结合、抑制IκBα蛋白磷酸化和降解等方式发挥对NF-κB信号通路的抑制作用^[12-15]。除了植物，作为生物界第二大物种，大型真菌也是抗炎药物的重要来源。与上文所述的植物来源萜类化合物抗炎机制不同的是，真菌来源的萜类化合物主要通过减少机体肿瘤坏死因子、一氧化氮、白细胞介质等炎症介质的产生，进而减轻炎症反应。例如，从毛韧革菌和硫色绚孔菌中分离得到的几种萜类化合物均具有可观的抗炎水平^[9,16]。

1.1.3萜类化合物生物合成途径

经过科学家数十年的艰辛探索，萜类化合物的生物合成路线已经较为清晰，可分为三个阶段。首先，由两个经典途径合成萜类共同前体物质异戊烯焦磷酸（isop-entenyl diphosphate，IPP）和烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）（见图1.1）。2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途径的底物是丙酮酸和3-磷酸甘油醛，在DXS、DXR、ispD、ispE、ispF、ispG和ispH等酶的作用下，生成IPP和DMAPP。甲羟戊酸（mevalonate，MVA）途径的底物是乙酰辅酶A，在ERG10、ERG13、HMGR、ERG12、ERG8和MVD1等酶的催化下，生成IPP和DMAPP。IPP和 DMAPP可以在异戊烯基焦磷酸异构酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI）的作用下相互转化^[17]；接着，一分子DMAPP和若干分子IPP在异戊烯转移酶（prenyltransferases，PT）作用下缩合成香叶基二磷酸（geranyl diphosphate，GPP）、法尼基二磷酸（farnesyl diphosphat-e，FPP）和香叶基法尼基焦磷酸（geranylfarnesyl，GFPP）等不同长度的直接前体；随后，这些直接前体在各种萜类合酶（terpene synthases，TPSs）催化下生成单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜等众多不同类型的直链、单环或多环的多样性萜类骨架，萜类骨架在双键还原酶、酰基化酶、糖基转移酶、细胞色素P450等后修饰酶作用下，形成具有不同生物活性的萜类化合物^[18]。纵观萜类化合物整个生物合成途径，可知萜类合酶是形成具有高度结构多样性终产物的关键元件。