摘 要

三维体外细胞培养打破传统二维培养在细胞的形态、极性、基因表达乃至功能状态方面与体内生理状态不同步的限制，能够较好地模拟细胞在生物组织体内贴近真实的生存状态，对体外细胞生物学功能的深入解析产生有力的推动。水凝胶因其高生物相容性，生物降解性及一定的机械强度，在组织工程领域尤其是肿瘤细胞研究方面被广泛用来构建所期望的三维组织结构。本研究中通过紫外光聚法构建以GelMA水凝胶为基础的三维肠癌模型，对比HCT116细胞在二维与三维体外培养中的生长情况并评价其对药物5-Fu的敏感性，确立三维培养的优势。Live/Dead实验表明GelMA水凝胶具有较低的细胞毒性，HCT116细胞在水凝胶中的存活率大于85%。质量溶胀比研究表明GelMA水凝胶具有优异的力学性能。药物耐受性实验显示HCT116细胞在以GelMA水凝胶为基础构建的3D体系中表现出比2D培养更显著的耐药性。这说明以GelMA水凝胶为支架的三维细胞培养模型将在肿瘤细胞生物学特性解析及药物疗效评估方面得以广泛应用。

关键词：肿瘤组织工程；三维细胞培养；GelMA水凝胶；耐药性

Abstract

In vitro three-dimensional cell culture system provides a better environment for cell morphotogy, polarity, gene expression and functional status, comparing to the traditional two-dimensional culture. The advantage of three-dimensional cell culture advances the research of cell function. Hydrogels are widely used to construct the desired three-dimensional tissue structure in tissue engineering, especially in tumor cell research, due to their high biocompatibility, biodegradability and certain mechanical strength. In this study, the three-dimensional colon cancer model was successfully constructed using GelMA hydrogel as scaffold and HCT116 cell live as seed cells under UV irradiation in the presence of photo initiator I2959. The morphotogy of HCT116 cells in two-dimensional and three-dimensional culture was recorded and the difference of 5-Fu sensitivity between two dimensional culture and three dimensional culture was evaluated. The swelling ratio results show that GelMA hydrogela have excellent mechanical properties. The results of Live / Dead assay showed that GelMA hydrogel had lower cytotoxicity and the survival rate of HCT116 cells in hydrogels was more than 85%. Drug tolerance studies showed that HCT116 cells in 3D culture condition displayed a more resistant drug resistance than 2D culture. These data suggested that the three-dimensional model will be widely used in the analysis of the biological characteristics of tumor cells and the evaluation of drug efficacy.

Key Words: tumor tissue engineering; three - dimensional cell culture; GelMA hydrogel; drug resistance

目录

摘要 I

Abstract II

1 绪论 7

2 GelMA水凝胶的制备及表征 8

2.1 GelMA合成 8

2.1.1 实验试剂 8

2.1.2 实验仪器 8

2.1.3 GelMA制备及纯化 9

2.2 水凝胶溶胀比测定 9

2.2.1实验仪器 9

2.2.2水凝胶Ws、Wd测量及数据处理 10

3 2D、3D细胞培养 11

3.1 试剂及仪器 11

3.1.1 实验试剂 11

3.1.2 实验仪器 11

3.2 解冻细胞 12

3.3 含细胞水凝胶的构建 12

3.3.1 2D细胞平面培养 12

3.3.2 3D细胞-水凝胶共培养 12

3.4 细胞毒性分析 12

3.4.1 48孔板细胞毒性分析 13

3.4.2 GelMA水凝胶细胞毒性分析 13

4 药物敏感性测定 14

4.1 5-Fu母液制备 14

4.1.1 实验试剂 14

4.1.2 实验仪器 14

4.1.3 5-Fu药物处理液配制 14

4.2药物处理 15

4.3细胞活力测定 15

5 结果与讨论 16

5.1 2D、3D培养细胞形态学表征 16

5.2 GelMA水凝胶形态及溶胀比测量结果 18

5.3 Live/Dead细胞活力测定结果分析 20

5.4 药物剂量反应曲线结果分析 21

参考文献 23

致谢 24

第1章 绪论

三维细胞培养(three-dimensional cell culture，TDCC)是组织工程中一种十分重要的研究手段。三维细胞培养是指将具一定三维空间结构的支架载体与各种待细胞在体外进行共培养，保证细胞能在支架材料的三维立体空间结构中自由迁移和生长，最终形成预期的细胞-载体复合物三维结构。体外培养细胞成功与否的关键因素是培养体系能否成功模拟细胞在生物体内的生长微环境。培养体系的核心是培养细胞与培养环境之间的相互作用。不同于传统的二维单层平板细胞培养,三维细胞培养是在外基质中对细胞进行培养, 保证细胞能够正常分化并最终形成实验预期的三维结构。在肿瘤细胞研究领域中，传统二维细胞培养只能通过对二维平面上培养的细胞进行特定的基因操作进而解析那些特定基因与肿瘤细胞生物学行为之间的联系，并不能准确地反映肿瘤发生过程中的肿瘤组织的形态学特征。相反地，动物模型虽然能够准确地反映肿瘤发生的形态学特点却又因实验体在相似性和经济性等方面的要求而不适用于大规模地培养研究工作，且因动物模型本身的限制导致在实验过程中不能对肿瘤发生过程进行实时观察。三维细胞培养则成功地结合了二维细胞培养在肿瘤细胞分子生物学研究与动物模型在肿瘤组织形态可观察之中的优点，能够最大程度地在体外构建出一个与生物体内细胞生长环境相似的系统。三维细胞培养因其在模拟肿瘤细胞在生物体内的生长微环境及培养条件直观可控方面所具有的显著性优势，现已成为一种在高通量研究特定基因与细胞表型之间的关系及细胞生物学行为变化过程中重要的实验手段。近年来，三维细胞培养技术在筛选新型抗肿瘤药和肿瘤药物毒理实验方面得以广泛应用。

三维培养的概念最早出现在上世纪初期。20世纪40、50年代，Holtfrete和Moscona等学者先后报道了一种多细胞球聚集体的体外培养实验方法，至此，三维细胞培养拉开了其在生物学研究史上的序幕。1961年，Moscona在研究悬浮状态下多细胞球聚集体的生长与诱导分化时，使用一种将细胞置于旋转摇床之上锥形瓶中的实验手段，成功让培养的细胞形成了多细胞聚集体。这一新型的三维培养方法之后被命名为“Moscona’s method”。20世纪70年代初，以Sutherland为代表的学者们创造性地使用旋转培养法并让肿瘤细胞成功形成肿瘤多细胞球结构。之后，肿瘤多细胞球模型开始作为体外研究肿瘤细胞放疗效果的重要细胞生物学实验材料并沿用至今。20世纪90年代后期，以旋转壁式生物反应器为代表的改进的三维旋转细胞培养系统通过结合预置生物支架开始逐渐取代传统的旋转瓶培养体系在肿瘤组织三维体外培养和三维肿瘤细胞生物学特征解析领域中的地位并开始发挥出十分重要的作用。传统的二维单层平面培养技术之前在肿瘤细胞体外模型的构建及肿瘤细胞生物学行为解析中一直发挥着主导作用，但由于二维平面培养方法本身的限制和肿瘤细胞在传代次数上的制约，所培养的细胞往往在细胞形态、基因表达水平和细胞功能状态方面与体内肿瘤细胞的实际状况相距甚远。故二维肿瘤细胞培养模型在肿瘤病理机制的研究中受到越来越多的挑战，需要构建一种全新的细胞培养模型来适应实验需求。肿瘤细胞能在一定的时间和空间条件下表现出特殊的肿瘤结构和生长行为。上世纪七八十年代，科学家们开始认识到培养细胞微环境对肿瘤表型形成的重要性，通过研究肿瘤细胞生长的微环境成功认识到特定基因与肿瘤表型之间的相互关系。三维细胞培养技术弥补了传统二维单层细胞培养的不足，较好地模拟出了细胞在生物组织体内真实的细胞微环境，对体外细胞生物学功能的深入解析产生了有力的推动。近年来，三维细胞培养技术的蓬勃发展及肿瘤细胞生物学特性研究的步步深入，使得在模拟生物体内组织细胞生长微环境方面具显著优势的三维细胞培养在肿瘤的细胞生物学特征解析和抗肿瘤药物的药效评估中受到越来越多的关注。