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固定化光合酶改性及作用底物适应性研究毕业论文

 2020-02-19 14:36:04  

摘 要

日常生活中装修材料的大量使用使得室内空气中含有大量有害的有机污染物,寻找合适的室内空气治理方法迫在眉睫。前期实验发现菠菜叶中制备所得的光合酶系统固定在海藻酸钙水凝胶后中对VOCs中的甲醛有一定的降解效果,但对非极性的VOCs处理效果不明显。拟通过将光合酶系统固定在不同的基质材料中并观察它们对甲醛以及甲苯的降解作用的不同。

将光合酶固定在海藻酸钠与壳聚糖质量比1:1的混合基质中后,与其他三种不同的固定基质相比,在可以短时间处理80%以上的甲醛的同时,还可以处理75%以上的甲苯。结果表明提高基质对底物的亲和力有助于提高光合酶系统的作用效果,这说明光合酶系统对VOCs可能会具有普遍的作用,今后在固定化基质方面多做改进,有望使得光合酶系统在空气治理中发挥巨大的作用。

关键词:光合氧化酶;固定化;基质;清除甲苯

Abstract

The large number of use that decorates material in daily life makes indoor air contains a large number of harmful organic pollutants, looking for proper indoor air treatment method is extremely urgent. Previous experiments showed that the photoenzyme system prepared from spinach leaves fixed in calcium alginate hydrogel had a certain degradation effect on formaldehyde in VOCs, but no obvious effect on non-polar VOCs. The photolytic enzyme systems were immobilized in different matrix materials and their degradation effects on formaldehyde and toluene were observed.

When the photase was fixed in the mixed substrate with a 1:1 mass ratio of sodium alginate and chitosan, compared with the other three different fixed matrices, more than 80% formaldehyde and 75% toluene could be treated in a short time. The results show that improving the affinity of substrate to substrate is helpful to improve the effect of photoenzyme system, which indicates that the photoenzyme system may have a general effect on VOCs. In the future, more improvements in immobilization of substrate are expected to make the photoenzyme system play a huge role in air treatment.

  • Key Words:photooxidase;immobilization;matrix;Removal of toluene

目□□录

第1章 绪论 1

1.1 VOCs的来源及危害 1

1.2 VOCs的生物学治理 2

1.3 酶的固定化基质 3

第2章 实验器材及方法 4

2.1 实验器材 4

2.1.1实验材料 4

2.1.2实验仪器 4

2.1.3实验药品 5

2.2 实验方法 5

2.2.1植物光合酶系统的制备 5

2.2.2酶含量的测定 6

2.2.3酶活性的测定 6

2.2.4光合氧化酶的固定 6

2.2.5固定化酶降解甲醛作用观察 7

2.2.6固定化酶降解甲苯作用观察 8

第3章 实验结果分析与讨论 9

3.1光合酶系统的制备 9

3.2酶含量的测定 9

3.3 酶活性的测定 9

3.4光合酶系统的固定 10

3.5不同固定化酶对甲醛的降解作用 12

3.6不同固定化酶对甲苯的降解作用 13

第4章 总结与展望 15

参考文献 17

致 谢 18

第1章 绪论

随着现代社会的工业发展,许许多多的挥发性有机物(Volatile Organic Compounds,简称 VOCs)进入到我们的生活中,并且可以说它们几乎无处不在。因为它们对人体和环境都有着不小的伤害,找到治理这些污染的方法对于人们健康生活以及社会良好发展显得至关重要。在本实验室已证实固定化的植物的光合氧化酶系统对甲醛有一定的降解作用的前提下,希望能通过改变固定化基质或使用不同配比的混合固定化基质来改变被固定酶活性中心周边的微环境,使酶微改性可作用于一些疏水的有机污染物,以扩大其底物适用范围来达到治理室内复杂的空气污染问题的期望。

1.1 VOCs的来源及危害

VOCs的来源可以被初步划分为天然来源和人为来源。其中天然来源的VOCs排放主要是来自于植被的次生代谢反应,因此是不可控的排放来源[1],但是人为来源的VOCs的排放量是远远大于天然来源的VOCs的排放量的。

日常生活生产中出现的人为来源的VOCs可被划分为移动源和固定源[2],移动源VOCs主要来自柴油机和机动车不完全燃烧排放出的尾气;固定源VOCs主要来自工业上使用的一些有机溶剂挥发,以及日常生活中使用的一些在生产过程中添加挥发性有机物的装修材料或家具等。

值得重视的是大部分的VOCs都对人体具有相当大的毒害作用,不仅会严重损害人的视力以及嗅觉,还对毛发,皮肤以及内分泌系统有着很大的潜在威胁,其中甲醛和苯系物更是被确定为了致癌物质。其次它们同样严重影响着动植物的健康生长,对种植业以及畜牧业有着巨大的危害。除此之外在工业生产中一些具有毒性的VOCs有可能会引发中毒事故,同时由于有机物大都是易燃易爆的会导致燃烧爆炸的事故的发生,非常不利于生产的安全进行。最后大多数的VOCs还会与臭氧反应,破坏臭氧层以致形成空洞,加剧地表紫外辐射的危险,同时VOCs中还存在大量的温室气体会加剧温室效应[3,4,5]

现代社会的发展速度越来越快, 伴随着发展而来的VOCs污染问题也越来越严重。而且现在人们大部分的时间都是在室内度过的,在了解到了室内空气污染问题对身体健康存在巨大威胁后,为了能够健康的工作与生活,找到高效的室内VOCs治理管控技术的需求就变得越来越迫切了。

1.2 VOCs的生物学治理

现在的 VOCs的治理技术主要有两个思路,分别是针对前端的源头治理和针对末端的应对性治理。源头治理主要是通过创新生产工艺的流程, 改进生产的设备, 以及加大研发的投入, 来降低VOCs的排放甚至实现0排放。这显然对生产技术手段的要求特别高,暂时还很难实现并且进度缓慢。因此对于VOCs的治理往往采用的是末端治理的方法。而末端治理技术又可以划分为两大类,一类是回收利用的技术(主要是吸附吸收),另一类是销毁技术(主要是催化燃烧以及生物降解)。其中生物降解法不易产生二次污染对环境更加友好,并且条件温和操作简单更加适合用来处理居室内的空气污染问题[6]

生物降解法主要分为绿色植物法,微生物法以及酶处理法[7]。利用绿色植物来治理居室内空气污染主要依靠的是其茎叶吸收作用以及其体内的新陈代谢作用。比如 芦荟、龙舌兰、吊兰、虎皮兰这些室内的绿色植物对空气中的污染物有着不错的处理效果, 它们都可以通过体内的新陈代谢作用将室内的VOCs如甲醛、苯系物等转化为生命活动所必需的氨基酸、糖类等物质。使用绿色植物来治理室内空气污染不仅存在耗费时间过久的问题,而且其叶片会因为长期暴露在VOCs浓度过高的环境中出现不同程度上的损伤。所以绿色植物法不能成为室内空气污染的完美解决方案。微生物法是利用其对空气中的污染物的代谢作用, 可以将一些亲水的有机污染物分解为水、二氧化碳或其他无机盐类等无害的小分子。这种方法的局限性在于占地大,影响条件多及只可分解亲水有机物。酶处理法主要是利用人工合成的有机高分子材料来模拟酶的作用来对空气中的VOCs进行催化降解,目前这方面的相关研究还较少技术也尚未成熟。

本实验室有过利用植物光合氧化酶系统对以甲醛为例的VOCs进行氧化分解的研究,并初步证实了植物的光合氧化酶确实对甲醛有着相当不错的降解作用。但从酶学理论分析以及前期实验观察显示,使用海藻酸钙包埋固定的光合酶系统目前可作用的底物仅限于少量亲水性小分子有机物。然而空气中存在的许多有机污染物中有很大一部分都是疏水的,所以如果想直接利用植物的光合酶系统来彻底解决室内复杂多样的污染问题,暂时也还是不太现实的。不过,从理论上分析如果能将光合酶系统固定在合适的基质中,使其处在一个相对疏水的微环境中,可能会有助于空气中的疏水有机污染物与酶的活性中心结合乃至被氧化降解,起到治理污染问题的效果。如果真的能通过改变固定化基质的成分来扩大光合酶系统的底物适用范围,使其可以作用于各种各样的VOCs(不管是疏水还是亲水),那么就有望找到解决室内空气复杂污染问题的完美解决方案。

1.3 酶的固定化基质

在工业生产中,大量生物催化酶的使用极大的提高了生产效率。不过,从生物体中提取出的酶往往不能直接加入到工业生产的反应体系中,还至少需要经过一步叫做固定化的加工。用一些固体材料来把想要使用的生物催化酶束缚或限制在一些固定的区域内就叫做酶的固定化[8]。在这种情况下被固定的酶仍然能够很好的进行一些其特有的催化反应, 并且可以被回收重复使用。而且与未固定就使用的游离酶对比时, 被固定化再使用的酶在它高效专一及温和的酶催化反应特性不变的前提下, 还克服了未经固定化的酶的不足,有着一系列的优点,比如说在储存中变得更加稳定,分离回收变得更加简单,工艺也变得简便并且操作也更加连续可控。

酶的固定化方法主要可以划分为物理法(主要是物理吸附法和包埋法)和化学法(主要是交联法和共价结合法)。其中通过物理法固定得到的固定化酶可以将其原本的催化活性保存的很好,但是其载体可能会具有一些空间阻碍作用,使得底物不能很好的与酶的活性中心结合。其次我们要知道酶的活性中心在不同的微环境中,其空间构象可能会发生一定程度上的细微改变,而酶与底物作用的专一性又是由活性中心的构象所决定的。想要通过改变固定化基质的成分降低其对底物的空间阻碍的同时还可以适当扩大酶的底物适用范围,就应该先对一些常用的固定化基质做一定的了解。

固定化基质根据材料可分为高分子材料, 磁性材料, 纳米材料和介孔材料[9]。高分子材料包括天然高分子材料与人工合成高分子材料, 其作为固定化基质的优势在于来源广成本低。天然高分子主要是纤维素及其衍生物,从甲壳中提取的壳聚糖,以及从海藻中提取的海藻酸钠等。对天然高分子材料进行修饰加工或者直接人工合成得到的材料属于人工合成的高分子材料,有着比天然高分子更优异的的性能。由于高分子材料的生物相容性较差,其他的磁性材料,纳米材料以及介孔材料都是近些年来研究的尺寸较小的固定化材料。

本实验室以往使用的固定化酶是以海藻酸钙水凝胶包埋的,海藻酸是两种醛酸组成的混合多糖,具有较多的自由羧基和羟基,当它与二价阳离子相遇就会形成极为亲水的水凝胶[10]。正是它的这种亲水性阻碍着固定化酶作用于疏水性底物。不过自然界存在着一种也是唯一一种天然碱性多糖——壳聚糖[11],并且其氨基酸会在在适当的pH下质子化形成聚阳离子电解质,而海藻酸钠的羧基在水中会离子化形成聚阴离子电解质[12,13]。同时使用两种材料按不同配比相互混合,通过正负电荷的相互作用,将基质中的电荷屏蔽掉,再来对光合酶系统进行固定就有望达到扩大其底物适用范围的期望。

第2章 实验器材及方法

2.1 实验器材

2.1.1实验材料

超市果蔬区购买的新鲜菠菜,无虫洞无老叶黄叶,去除根和叶柄后用清水洗净后晾干备用。购买于国药集团化学试剂有限公司的化学纯海藻酸钠,分子式为(C6H7NaO6)n,用纯水配成质量分数为2%的海藻酸钠溶液备用。购买于潍坊海之源化工有限公司脱乙酰度92%的壳聚糖,分子式为(C6H11NO4)n ,用1%的乙酸溶液配成溶液,再经稀NaOH调pH至5,最终质量分数为4%,备用。

2.1.2实验仪器

实验所用仪器见表2.1

表2.1 实验仪器

仪器名称

型号

生产公司

纯水机

2000B

北京长风仪器仪表公司

离心机

TGL-16G

上海安亭科学仪器厂

分光光度计

UV-1700

SHIMADZU

电热鼓风干燥箱

DGX-914313-1

上海福玛实验设备有限公司

冷冻离心机

Allegra 64R

BECKMAN COULTER

制冰机

XB-85

宁波新芝生物科技股份有限公司

磁力搅拌器

85-2

常州国华电器有限公司

电子天平

JA-502

上海沪析实业有限公司

其他常用器皿主要有医用纱布,玻璃棒,1000ml烧杯,500ml烧杯,250ml烧杯,50ml烧杯,量筒,100ml容量瓶,50ml离心管,5ml离心管,剪刀,胶头滴管,镊子,80目尼龙布,玻璃培养皿,玻璃比色皿,螺口带盖试管,精密pH试纸,针线,定性滤纸,白炽灯,3L锥形瓶及橡胶塞。

2.1.3实验药品

实验所用药品见表2.2

表2.2实验药品

名称

分子式

纯度

生产厂家

蔗糖

C12H22011

分析纯

国药集团化学试剂有限公司

无水氯化钙

CaCl2

分析纯

泗联化工厂

氯化钠

NaCl

分析纯

国药集团化学试剂有限公司

氢氧化钠

NaOH

分析纯

国药集团化学试剂有限公司

盐酸

HCl

分析纯

信阳市化学试剂有限公司

2,6-二氯吲哚酚钠

C12H6C12NNaO2·XH2O

分析纯

阿拉丁

TRIS

NH2(CH2OH)3

分析纯

ANGUS

乙酸铵

C2H7NO2

分析纯

国药集团化学试剂有限公司

甲醛水溶液

CH2O

分析纯

国药集团化学试剂有限公司

乙酸

C2H4O2

分析纯

国药集团化学试剂有限公司

乙酰丙酮

C5H8O2

分析纯

麦克林生化科技有限公司

无水乙醇

C2H5OH

分析纯

上海振兴化工一厂

实验用试剂配制:

0.35mol/L NaCl溶液:称取适量NaCl用纯水配成0.35mol/L的溶液,冰浴备用。

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