摘 要

由于我国是人口大国，土地资源是非常重要的一种资源，而我国的土地资源紧缺，还又部分土地因为土壤质地变化、地下水位高度的影响以及有些地方灌溉方式不当导致地下水位上升而积盐引起土地盐碱化，对我国的农牧业有着重大的影响，严重的还会因此影响当地居民的生活，可以说是亟待解决的问题。虽说我国已经关注土壤盐碱化很久了，而且也已经想出了很多的方法去解决这一问题，但是一直没有一种方法能够不需要动用过大的工程，因为动大工程有一个大问题，而且有些生物方法会占用很多时间来进行修复可能修复效果也不尽人意，因此需要研究一种方法能够在不占用大量的时间还能够有足够的成效的方法，所以我们需要一种新的方法来解决这一问题。

目前，微生物法已经进入了国内学者的视野之中。本文主要介绍了如何筛选出一株高效的能够在高碱性地带表达的且能够生存的产纤维素酶嗜碱菌来降解盐碱地中的秸秆并一定程度上修复盐碱地。产纤维素酶嗜碱菌能够在高碱性的地区生存，并产出纤维素酶以降解残留在盐碱地中的秸秆，使盐碱地中的有机质增加，使得整个盐碱地的营养增加，有机质中的磷等元素进入土壤中，改善土壤的理化性质，由此可以改良土地盐碱化。本实验在前人的研究基础上，进行的研究内容如下：

本研究从山东东营某盐碱化土壤中分离出一些菌株进行初筛，由得到的初筛的菌株再进行复筛，得到三株分别命名为A1，A2，A3的菌株。在碱性条件下产酶能力以及菌落大小均较佳的菌株进行活性测定，在初始pH10.2条件下，培养4d后，培养液的达到了最大值为1.2405，其pH不变。

之后对所得菌株进行单因素实验。通过单因素实验得到产纤维素酶嗜碱菌的最佳的产酶条件为：温度在33°C，初始pH=10.5，转速为180r/min，接种量为8%。

关键词：嗜碱细菌；菌株筛选；纯化；产酶条件

Abstract

Since China is a country with a large population, land resources are a very important resource. However, China's land resources are in short supply. In addition, some land is salted due to changes in soil texture, height of groundwater level, and improper irrigation in some places. Causing salinization of land has a major impact on China's agriculture and animal husbandry. Seriously, it will affect the lives of local residents. It can be said that it is an urgent problem to be solved. Although China has been paying attention to soil salinization for a long time, and has come up with many ways to solve this problem, there has not been a way to not need to use too much engineering, because there is a big problem in the big project. Moreover, some biological methods take a lot of time to repair. The repair effect may not be satisfactory. Therefore, we need to study a method that can achieve sufficient results without taking up a lot of time, so we need a new method. Solve this problem.

At present, the microbial law has entered the field of domestic scholars. This paper mainly introduces how to screen a high-efficiency cellulase-producing alkalophilic bacteria that can be expressed in a high alkaline zone to degrade the straw in the saline-alkali soil and repair the saline-alkali land to some extent. Cellulase-producing alkalophilic bacteria can survive in highly alkaline areas, and produce cellulase to degrade the straw remaining in the saline-alkali soil, so that the organic matter in the saline-alkali soil increases, so that the nutrition of the whole saline-alkali land increases, and phosphorus in the organic matter. The elements enter the soil and improve the physical and chemical properties of the soil, thereby improving the salinization of the land. Based on the previous research, this research is as follows:

In this study, some strains were isolated from a saline-alkaline soil in Dongying, Shandong Province, and the primary strains were rescreened to obtain three strains named A1, A2, and A3. The strains with better enzyme production ability and colony size under alkaline conditions were tested for activity. At the initial pH of 10.2, the culture medium reached a maximum value of 1.2405 after 4 days of culture, and the pH was unchanged.

The resulting strain was then subjected to a single factor experiment. The optimal enzyme production conditions for cellulase-producing alkalophilic bacteria were obtained by single factor experiment: temperature was 33 ° C, initial pH = 10.5, rotation speed was 180 r / min, and inoculum size was 8%.

Keywords: alkalophilic bacteria; strain screening; purification; enzyme production conditions

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 我国土壤盐碱化现状 1

1.2 土地盐碱化的危害 1

1.3 土地盐碱化的治理方法 2

1.3.1 工程措施 2

1.3.2 农艺措施 2

1.3.3 化学改良 2

1.3.4 微生物法改良 3

1.4 嗜碱菌的发展与应用 3

1.5 产纤维素嗜碱菌培养中的影响因素 3

1.5.1 温度的影响 3

1.5.2 pH条件的影响 4

1.5.3 转速的影响 4

1.5.4 接种量的影响 4

1.6 研究课题的意义以及内容 4

1.6.1 研究课题的主要目的及意义 4

第二章 产纤维素嗜碱菌的筛分、纯化及其活性研究 5

2.1 引言 5

2.2 实验方法 5

2.2.1 菌源选取 5

2.2.2 实验仪器及试剂 5

2.2.3 实验方法 6

2.3 实验结果与讨论 8

2.3.1 产纤维素酶菌株的分离与初筛 8

2.3.2 滤纸条崩解实验 9

2.3.3 生长曲线的测定 9

2.4 本章小结 10

第三章 产纤维素嗜碱菌的产酶条件优化 12

3.1引言 12

3.2 实验方法 12

3.2.1 产纤维素酶量的测定 12

3.2.2 酶活测定方法 13

3.3 单因素实验 13

3.3.1 培养时间对产酶的影响 14

3.3.2 转速对产酶的影响 14

3.3.3 接种量对产酶的影响 15

3.3.4 pH变化对产酶的影响 16

3.3.5 温度变化对产酶的影响 16

3.4本章小结 17

第四章 结论与存在的问题 18

4.1结论 18

4.2 本实验存在的问题 18

参考文献 19

致 谢 21

绪论

1.1 我国土壤盐碱化现状

我国约有9913万 的盐渍土，其中现代盐渍化土壤3693万，残余盐渍化土壤4487万，此外，潜在盐渍化土壤约1733万^[1]。我国盐碱土资源总面积约9900万，主要分布在东北平原，西北干旱、半干旱地区，黄淮海平原及东部沿海地区。其中，西北干旱区是我国最大的盐碱土分布区，总面积约1300万，主要包括青海、新疆、内蒙古西部和甘肃河西走廊地区；其次为滨海盐碱土区，面积约800万，主要分布在黄海、渤海和东海的海岸沿线^[2]。

1.2 土地盐碱化的危害

盐碱化使土壤各种性质变差，pH以及土壤的元素含量等均与普通土壤有所区别，使得大部分植物都无法在该地区生存，表现在：1、土壤中的有机质会比其他正常土壤要少很多。因为土地盐碱化，使得盐碱地中的野生植物无法自由生长，也限制了其中有机物质含量的增长，所以土壤中的有机物质含量也会相对较低，从而影响到土壤各项性质^[3]。2、土壤营养条件变差。在人为因素如大额灌溉的影响下，使得很多的氮元素因此随着水流失，而有机质可以使土壤中的磷元素的量保持不变，有机质的分解产物会增加磷元素的含量并且可以使得磷元素的作用更加强大。盐碱土有机质含量低，会减弱磷的功能，而且盐碱地的pH居高不下对磷元素也会产生毒害，使得磷元素无法发挥本来的作用。pH高则碳酸钙含量高，磷其中的离子结合后会变得及其难溶，使得磷很难被植物吸收，此外，锌、锰、铁、铜等微量元素也受到了相同的影响。3、土壤物理性状不良。盐碱化土壤结构差，很多土壤经水浸后会立即散开，不能保证土壤结构形态不破碎，土壤中的孔隙比较少，土壤很难通过各种方式集合成团，且无法保证能够锁住水分，使水分不蒸发达到适合种子生长发芽的湿度，土壤胶体Na离子含量高，降低了水在土壤中移动的速度和深度，使得植物根茎无法从土地中吸收足够的水分，很多水分因此得不到使用造成土壤不能够提供足够的水分以维持植物的生长。土壤的温度还随着季节变化而改变，春秋时土地在被太阳光照时的温度上升较为缓慢，让农民无法在合适的时间进行种植，植物的幼体也被影响，夏季时土地温度上升快，最高温度高，将土壤中的水分快速蒸发并使得盐的浓度增大。4、土壤微生物活动受到盐碱的抑制，固氮菌、硝化菌很少，活性差，因而土壤中的氨化作用和硝化作用微弱^[4-5]。

由于盐碱化地带的盐溶液浓度过高，使得在上面生长的作物受到摧残。由于盐碱土溶液浓度过高，渗透压大，让作物很少可以在盐碱地中得到足够的水分与营养物质，更有甚者，盐溶液浓度太高使得细胞中的水分减少，而大量的不需要的元素进入体内，需要的营养元素又无法从盐碱地溶液中获取，就这样，作物体内的元素平衡被打破了，其正常的代谢活动受到影响，无法继续合成生存所需的蛋白质和酶，使得各类可溶性的盐类离子在细胞中的浓度急剧上升，从而产生离子毒害，危及作物的生长发育，甚至死亡。不同盐类危害的程度是不同的，常见的几种可溶性盐类对作物的危害顺序是：碳酸钠gt;氯化镁gt;重碳酸钠gt;氯化钠gt;硫酸钠^[6]。

总之，土壤条件受到盐碱化的影响后会不适合作物在其上生长，还会使得原本就生长在那的作物减产，严重的更是会让其枯萎死亡，从而限制了农业生产的发展，土壤盐碱化是当地发展农业经济的重要限制因素^[7]。因此我们非常有必要解决这一问题，将土地恢复到原来的样子，这样我们才能在有限的空间里制造出更大的价值。

1.3 土地盐碱化的治理方法

盐碱地治理的主要目的是改变土壤的各项指标，比如土壤的含砂量，松软程度，颜色以及土壤的pH值，铵态氮、硝态氮和一些元素指标等等，为了给植物一个足够好的生长环境进行发育，才能让作物能够做到高产量，高效率。接下来我将简单介绍几种盐碱化土地改良的措施，重点说一下微生物法改良^[8]。

1.3.1 工程措施

可以利用在盐碱地中修建排灌系统，比如井、沟等，再在土地中埋一些地下管道进行排水或者灌水。通过竖井排水还能够减少地下水的深度，使得地下水表层淡化，根层的盐分会因此脱离得更快一些。

1.3.2 农艺措施

顾名思义是通过不同的农耕方式，抑制或降低土壤中水分的挥发，使土壤中盐的浓度降低，盐分也无法聚集在一起，从而能够达成改良的目的。同时，此法还是化学法改良和生物法改良的基础。

1.3.3 化学改良

此法是利用化学中最基础的知识，即酸碱中和原理来进行的。此法有两个优良的效果：第一是可以优化土壤结构，增强盐碱地的祛盐能力。第二是可以调节土壤的酸碱度，增加盐基代换。

1.3.4 微生物法改良

微生物法可以将盐碱土中的微量元素提高，改变植物的生长环境，使土壤中盐溶液的浓度降低，减少对作物根茎等处的细胞的抑制作用，由此可以将盐碱地的pH和有机质增加并通过这个方法修复土壤。在盐溶液浓度极高的状态下，使用微生物法去实验，将菌种种植到土壤中可以提高作物的活力，加快作物的代谢，由此可知，利用此方法可以降低盐溶液对作物的伤害并促进作物的生长与繁殖。

1.4 嗜碱菌的发展与应用

从1928年Downie发现第一个嗜碱菌Streptococcus faecalis以来^[9-10]，很多不同种类的嗜碱菌已从各个地区分离出来^[19]。微生物是一个大种类，其中嗜碱菌的种类也很多如真细菌、放线菌和真菌，既有好氧的，也有厌氧的类型，虽然有些许不同，但是他们都可以在高碱的环境下生存。时至今日，嗜碱菌还没有确切的定义，国内外学者根据耐受碱的程度不同作如下的区分：

嗜碱菌(alkalophile)：在pH9以上、在pH10～12之间的时候菌株生长状态最好，但在pH 6.5左右时可能不会生长，或者说生长速度减缓。

耐碱菌(alkalotolerant)：能在pH7～9 生长，大于pH 9.5不能生长 。

极端嗜碱菌(extreme alkalophile):最适生长pH为10或gt;10，专性嗜碱菌在pH=10的时候生长得最为旺盛，在pH低于8.0～9.0时不生长；即使pH高于10.0兼性嗜碱菌也能在其中生长。

我们需要使用的嗜碱菌在高碱状态下能够自由生存且能够在此环境下产出我们所需的产物，即各种酶资源。1984年，Horikoshi分离一株产碱性纤维素酶的菌株，并将纤维素酶组分的纯化工作完成了，并研究了酶的催化性质^[11]。

1.5 产纤维素嗜碱菌培养中的影响因素

1.5.1 温度的影响

因为我们的目的是需要降解盐碱地中的秸秆并改良土壤，而温度对菌体的生长和繁殖都有很大的影响，而我们需要的产物酶更是对温度有很高的要求。所以我们需要在低温下保存菌种，一般的菌体培养温度也是在室温即25°C左右^[12]。

1.5.2 pH条件的影响

pH值是影响细菌生长的一个重要因素之一，对其产酶的高低也有很大的影响。嗜碱菌的最适pH大致在9～12之间，而不同种的细菌对pH值的适应也不同，当细菌在最适区间的时候细菌的生长速度和繁殖速度才是最快的，而且也不会对细菌产生的酶造成任何的伤害，产出的酶也是最多的时候。

1.5.3 转速的影响

转速对细菌有一定的影响，转速越快，培养基中的溶氧量也越多，但是转速太快则会导致细菌无法生长，反而会使得细菌的死亡。所以我们也要挑选出合适的转速，使酶的更加高效。

1.5.4 接种量的影响

接种量的多寡对细菌也会有一定的影响，若初始的细菌数量不一样，则在初始时消耗的羧甲基纤维素钠也会更多，在开始时便使得营养物质含量降低，细菌的活性随之下降，导致产酶减少。因此接种量对细菌的生长会有影响。

1.6 研究课题的意义以及内容

1.6.1 研究课题的主要目的及意义

因为我国东北平原等地以及一些草原地区是一些生态脆弱的地带，这些地区受到土地盐碱化的影响，不仅会使农业发展受到极大的阻碍，而且还会严重影响到人民的生活，甚至一小部分的居民已经沦为了生态难民了。所以土地盐碱化是非治理不可的问题。

本实验旨在能够筛选出一株在高碱性的盐碱化地区中能够存活且能够自由的生长还可以产出足够高效的纤维素酶以降解盐碱地中的秸秆的菌株，通过测定各项指标，如CMC-刚果红水解圈、CMCasae（羧甲基纤维素酶活）以及滤纸崩解等。从自然界中获得高效的能够符合上述要求的菌株，并对各种菌株进行产酶条件的研究，选出能够符合我们要求的，并且能够产出足够高效的酶产物的菌株的生长条件。

产纤维素嗜碱菌的筛分、纯化及其活性研究

2.1 引言

因为微生物的体型比较小，要分离出其中一株或几株细菌是无法直接从样品中取得，所以我们需要进行几个步骤来将其筛选出来，并将他们一一纯化，总的步骤如下：

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