1. 研究目的与意义（文献综述）

细胞的生存与死亡都是细胞周期中的重要事件，生命体的生长、发育和稳态的维持都依赖于细胞生存与死亡的动态平衡。细胞死亡调控机制的研究是生命科学的一个基本课题。细胞死亡不仅在正常细胞中起作用，而且与许多重大疾病密切相关，例如，缺血性心脑血管疾病、心肌梗死、肝肾功能损伤、神经细胞死亡导致的老年痴呆等神经性退化疾病等；并且，细胞死亡还和癌症的发生发展及治疗有着直接的联系。癌细胞往往逃逸了细胞死亡机制的调控，造成癌细胞获得了无限生长的能力，同时，对化疗和放疗不敏感。

传统的观点根据形态学特征、死亡途径和是否可控等特点，将细胞死亡划分为凋亡(apoptosis)与坏死（necrosis）两种基本模式。其中凋亡被认为是受凋亡信号诱发、有序、可控的；而坏死是细胞受到意外损伤时，如极端的物理、化学因素或严重的病理性刺激的情况下发生的一种被动、混乱无序、不可控的死亡方式。因此，相较于对凋亡方式的大量而较全面的研究，对坏死的研究较少，坏死的机制还很不清楚。

随着对细胞死亡研究的逐渐深入，研究者发现，在机体内某些细胞坏死过程也是受特定信号激发的，并受到严格程序控制，degterev 等在2005年首次报道了一种新的程序性细胞死亡（programmed cell death，pcd），并将其命名为程序性坏死（necroptosis）。程序性坏死的发现颠覆了传统中将细胞坏死仅视为一种被动的死亡方式的观点。程序性坏死与坏死（necrosis）有着相似的形态学特征，但受细胞内信号通路网络调控，是一种caspase非依赖型的程序性细胞死亡方式，它由ripk1, ripk3, 和mlkl等信号蛋白调控，其中ripk1, ripk3是上游信号调控蛋白，而mlkl是死亡执行蛋白；ripk1, ripk3通过信号通路磷酸化修饰mlkl，使其激活。

2. 研究的基本内容与方案

研究目标：利用crispr/cas9基因编辑技术，对zbp1进行基因敲除，筛选得到稳定的zbp1基因knock-out细胞系。

zbp1（z-dna-binding protein 1）是细胞坏死(necroptosis)中的信号蛋白，是细胞内一种对病毒感染的内在感受器，是调节细胞程序性坏死和炎症反应的靶点。可通过对zbp1基因敲除，研究在细胞死亡信号刺激时，zbp1基因knock-out细胞死亡调控的异常和变化及缺陷，进而发现该蛋白在新的细胞死亡途径中的功能和作用。所以建立zbp1基因knock-out细胞系是后续实验的基础。

crispr/cas9是近年兴起的基因编辑技术，可以高效快速方便地对特定基因进行编辑和敲除，是继锌指核酸内切酶（zfn）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（talen）”之后出现的第三代基因组定点编辑技术。crispr/cas系统是一种原核生物的免疫防御系统，用来抵抗外来遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒，切割其核酸。通过人工修饰，crispr/cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在crispr/cas系统中，crispr/cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。研究者只需设计合适的与目的基因序列配对的向导rna（guide rna， grna），在grna和cas9蛋白的共同作用下，细胞基因组dna将被精确剪切。

3. 研究计划与安排

2月20至28日：了解研究背景、设计实验方案。

3月1日至4日：设计并合成引物grna。

3月5日至23日：克隆实验（载体酶切、引物退火、连接、转化、抽提质粒、测序），构建好同时表达grna和cas9的质粒lenticrispr-v2。同时进行puromycin筛选hela和293t细胞浓度预实验。

4. 参考文献（12篇以上）

[1]申兵冰,吴雄飞.程序性坏死研究进展[j].重庆医学,2018,47(03):406-409.

[2]巴微,逄越,李庆伟.程序性坏死(necroptosis)的分子机制[j].遗传,2014,36(06):519-524.

[3]胡艳红,张凡,张楚焌,孙天石,蕫一昕,李卫红.程序性细胞死亡形式研究进展[j].辽宁中医药大学学报,2018,20(12):85-89.