1. 研究目的与意义（文献综述）

细胞微环境（cellmicroenvironment）是细胞赖以生存的复杂环境。由多种支持细胞及结缔组织组成的基质（stroma），是构成上皮细胞微环境的主要成分，对上皮细胞的命运决定及形态发生具有一定的决定性作用。

乳腺基质由细胞外基质（extracellular matrix, ecm）和基质细胞构成。ecm 包括蛋白多糖，透明质酸，胶原，纤维粘连蛋白，层粘连蛋白等纤维蛋白，生长因子，趋化因子，细胞因子，抗体及代谢产物等。基质细胞主要包括成纤维细胞及脂肪细胞等支持细胞，血细胞以及免疫细胞。

乳腺成纤维细胞是构成乳腺上皮细胞微环境的重要成员，作为基质功能的主要行使者，调控乳腺上皮分支形态的发生。一方面，成纤维细胞分泌fgf（fibroblast growth factor）、igf(insulin-likegrowth factor)等多种生长因子，这些生长因子结合于上皮细胞上相应的受体，直接影响上皮细胞存活、增殖、迁移等多种行为，促进上皮分枝状形态发生。另一方面，成纤维细胞通过调控细胞外基质的重构（ecm remodeling）间接影响上皮细胞的功能。作为调控乳腺细胞外基质的管家，成纤维细胞可以分泌胶原，蛋白多糖，纤维连接蛋白等多种细胞外基质的成分。同时，成纤维细胞还可以合成基质金属蛋白酶（metalloproteinases , mmps)等蛋白酶，降解细胞外基质。通过调控基质的重构，不仅可以控制储存于细胞外质中的生长因子以及细胞因子的释放，还可以通过基质硬度的改变影响上皮细胞行为。因此，对于成纤维细胞的功能研究是阐明基质功能的重要方面。

2. 研究的基本内容与方案

（一）基本内容及目标

1、验证乳腺基质中成纤维细胞存在FGFR受体及主要作用类型

2、探究基质中FGF信号通路在乳腺发育不同时期的影响

3、基质中FGFR1、FGFR2基因敲除、过表达小鼠的表型分析

（二）技术方案

1、验证乳腺基质中成纤维细胞存在FGFR受体

（1）从野生型小鼠中分离出乳腺成纤维细胞，种植于基质胶中，进行体外培养。

（2）实验组用FGF2刺激，对照组不加FGF2，培养3天，。

（3）观察纤维细胞迁移情况。

2、乳腺成纤维细胞中FGFR的表达分析

（1）从野生型小鼠中分离出乳腺成纤维细胞。

（2）提取细胞内总RNA并进行纯度分析，反转录成cDNA。

（3）设计相关引物，利用qPCR技术检测细胞中FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4表达情况

3、基质中FGFR1、FGFR2基因缺失对乳腺发育的影响

（1）体外模型——FGFR缺失对乳腺成纤维细胞的影响

①分离培养FGFR1 fl/fl、FGFR2 fl/fl、FGFR1,2 fl/fl小鼠的乳腺成纤维细胞，体外培养

②利用Cre-Loxp技术构建出FGFR1 KO，FGFR2 KO，FGFR1,2KO质粒载体

③腺病毒转染后，利用流式细胞仪和western blot技术分别筛选出FGFR1敲除、FGFR2敲除、FGFR1和FGFR2同时敲除的成纤维细胞，种植于基质胶中。

④FGF2刺激，培养3天，观察细胞迁移情况。

（2）小鼠模型——FGFR缺失的表型分析

①利用Fsp-Cre的小鼠与目的基因小鼠杂交，得到FGFR1 KO，FGFR2 KO，FGFR1,2KO的小鼠。

②分别于小鼠出生后3周、5周、10周及怀孕期取乳腺进行Carmine 染色。

③观察乳腺导管延伸度、分支节点数及TEB数量，记录乳腺发育情况。

4、基质中FGFR1、FGFR2基因过表达对乳腺发育的影响

（1）体外模型——FGFR过表达对乳腺发育的影响

①分离培养FGFR1 fl/fl小鼠的乳腺成纤维细胞，体外培养

②利用CRISPER-CAS 9技术构建出FGFR1 过表达，FGFR2 过表达，FGFR1,2 过表达的质粒。

③腺病毒转染，利用流式细胞仪和western blot技术分别筛选出FGFR1过表达、FGFR2过表达、FGFR1和FGFR2同时过表达的成纤维细胞，种植于基质胶中。

④FGF2刺激，培养3天，观察细胞迁移情况。

（2）小鼠模型——FGFR过表达的表型分析

①利用CRISPER-CAS9技术得到FGFR1过表达、FGFR2过表达、FGFR1和FGFR2同时过表达的小鼠。

②分别于小鼠出生后3周、5周、10周及怀孕期取乳腺进行Carmine 染色。

③观察乳腺导管延伸度、分支节点数及TEB数量，记录乳腺发育情况

（三）主要实验方法：

1、RNA提取、纯度分析、逆转录

提取总RNA

细胞内总RNA利用试剂盒进行提取。提取步骤如下：

（1）终止培养后，吸出培养板孔内的培养液，使用PBS冲洗3次。

（2）向每孔中加入350 μl RLT lysis buffer提取试剂孵育10-15 mins，并轻轻摇晃培养板，使细胞和试剂充肥触。

（3）收集细胞并转移至离心管中，14000×g 离心 30 s。

（4）转移上清液于另一离心管中，加入等体积乙醇，轻轻颠倒，转移至RNeasy mini spin column，14000×g离心30 s。

（5）弃去管中液体，向离心柱表面加入RW1 700 μl 14000×g 离心 30 s清洗柱子，然后加入RPE 500 μl 14000×g 离心 30 s清洗柱子。

（6）14000×g 离心，空转柱子30 s。

（7）加入20 μl 无RNA酶的水于柱子膜中央，静置1 min后，14000×g 离心1min溶解RNA。

分析RNA纯度

取溶解的RNA稀释10倍，使用分光光度计测量波长为260 nm和280 nm时的吸光度，观察RNA纯度是否合格，并测得RNA浓度。所提取的RNA可保存于-80℃冰箱。

逆转录

使用takara试剂盒将RNA逆转录为cDNA，反应体系（20ul体系）如下：

设置PCR仪的反应条件为：85℃孵育15 mins，4℃终止反应。逆转录产物-80℃保存。

2、实时荧光定量PCR（Quantitative real-time –PCR，qPCR）

设计相关引物，进行扩增，反应体系（10ul）如下：

将上述试剂按顺序加入96孔板中，小心混匀后离心。使用实时荧光定量PCR仪对DNA进行扩增。扩增条件如下：

计算目的基因表达量

3、体外细胞培养

(1) 原代乳腺上皮类器官（organoid）的分离培养

分离：原代乳腺上皮类器官取自8-10周母鼠。取小鼠乳腺3#，4#和5#，机械切碎。在新鲜消化液（0.2% collagenase 和 0.2% trypsin）中消化30分钟. 450g离心10分钟。离心后取下层沉淀，加入DNase I消化5分钟内. 然后进行差速 (短暂上升至 450 × g). 收集下层沉淀，即为上皮类器官。

培养：提取的上皮类器官可种植于Matrigel，加入培养基(DMEM/F12 , 10 μg/mL insulin,5.5 μg/mL transferrin, 6.7 ng/mL selenium, 100 U/ mL penicillin, 和100 μg/mL streptomycin。

#61656;(2) 成纤维细胞的分离培养

分离：上清离心后细胞沉淀种植于细培养板上

培养：加入成纤维细培养基 （DMEM ，10% (vol/vol) FBS (Sigma), 10 μg/ mL insulin, 5.5 μg/mL transferrin,6.7 ng/mL selenium, 100 U/mL penicillin, 和100 μg/mLstreptomycin]）。30分钟后，换新的培养基，成纤维细胞即已经贴壁。成纤维细胞种植于低吸附版中过夜，即形成成纤维细胞球（fibrospheres）。

4、乳腺细胞染色

#61656; Carmine 染色：取4号乳腺平铺与粘附载玻片上。加入Carnoy’s solution （100% ethanol ： glacial acetic acid=3:1）中4 °C固定过夜， 75% ethanol 和流水冲洗后，在alum Carmine中染色4小时。 酒精脱水后至于二甲苯中，长期保存可至于水杨酸甲酯中，体视显微镜拍照。 Ductal length是指淋巴结中心至上皮分支最远端的距离。Branch number 指淋巴结外侧单位长度导管上分支的数量。TEB的数量是指整个4号乳腺上TEB的数量。ImageJ 进行数据分析。

#61656; Masson 染色：乳腺与 4%多聚甲醛中固定过夜，石蜡包埋，以5 um的厚度进行切片。应用试剂盒进行Masson染色。

#61656; HE 染色：石蜡切片后应用HE染色试剂盒进行染色。

5、Western blot技术

#61656; 按1×107细胞数量加入200 μl 细胞蛋白裂解液并加入蛋白酶抑制剂混合物裂解细胞，用枪头吸打，冰浴30mins。充分裂解后将含有细胞的裂解液吸入预冷的1.5 ml离心管中，4℃ 14000 rpm/min离心15 mins；收集上清液分装后–80℃保存，用于后续试验。

#61656; 上样和电泳：取20 μl蛋白样品-牛血清白蛋白BSA，加入蛋白裂解液调整为相同浓度的蛋白样品，加入6×SDS上样缓冲液混匀，99℃变性5mins。按上表顺序依次将试剂依次加入离心管中，振荡混合均匀后， 按顺序加入预制胶中，将凝胶放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液中，恒压140V，电泳。

#61656; 转膜：聚偏氟乙稀（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜在甲醇中浸泡10 s至全部浸湿。取出电泳后的SDS-PAGE凝胶，将滤纸、聚偏氟乙稀PVDF膜和SDS-PAGE凝胶置于转膜缓冲液中浸泡5 mins。25 V 电压转膜1 h。

#61656; 抗体孵育

（1）将转膜后的PVDF膜取出，使用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（Tris-

bufferedsaline containing 0.05% Tween-20, TBST）室温封闭1 h。

（2）将PVDF膜置入5%脱脂奶粉TBST缓冲液稀释的一抗4℃孵育过夜。

（3）室温恢复30 mins，TBST缓冲液冲洗3次，每次5 mins。

（4）辣根过氧化酶（horse radish peroxidase, HRP）标记的二抗室温孵育1 h。

（5）TBST缓冲液冲洗3次，每次5 mins。

#61656; 显色及图像分析

向冲洗过的PVDF膜上滴加新配置的增强型化学发光液（enhanced chemiluminescent, ECL），避光孵育5 mins，并进行曝光。对获得的条带使用Image J软件进行分析。

3. 研究计划与安排

第1周：了解论文题目，认识所需完成的主要内容和任务；搜集相关学术期刊、论文、文稿、专利、教材等资料，阅读后进行总结，对论题形成一个初步的系统性的认识。利用生物信息技术，对研究前沿进行分类整理和总结。

第2周：完成毕业论文开题报告，确定实验技术路线，确定具体的实验方案和步骤。

第3周：建立fgfr基因敲除/过表达的体外模型及小鼠模型，体外培养乳腺成纤维细胞

4. 参考文献（12篇以上）

【1】 pond ac, bin x, batts t,roarty k, hilsenbeck s, rosen jm. fibroblast growth factor receptor signalingis essential for normal mammary gland development and stem cell function. stemcells. 2013;31(1):178-89.

【2】gong sg. isoforms of receptors of fibroblast growth factors. j cellphysiol. 2014;229(12):1887-95.

【3】babaei b, davarian a, lee sl, pryse km, mcconnaughey wb, elson el,et al. remodeling by fibroblasts alters the rate-dependent mechanical propertiesof collagen. acta biomater. 2016;37:28-37.