摘 要

关键词：簇毛麦；R基因；分子标记；染色体定位

Chromosomal location and molecular markers development of NLRs type genes in Haynaldia villosa

student majoring in Seed science and Engineering Feng chenghao

Tutor Xing liping

Abstract：Haynaldia villosa is a wild relativeand an important third level gene resource pool of common wheat, Through the development of NLRs gene in Haynaldia villosa can expend the disease resistance gene resources of wheat r. In previous study of this laboratory, N the full-length NLRs type genes of the diploid Haynaldia villosa cv. 91C43 were enriched by a barley specific NLRs-baits library. In combination with the third-generation PacBiosequencing technology, the full-lengthNLRs genes database was built on the genomic level. In this study, to explore the corresponding homologous sequences, the contigs of NLRs gene sequences from Haynaldia villosa genome were compared with NLRs from genomic sequence of the close related specie barley and reference of common wheat cv. Chinese Spring by high-throughput bioinformatics method . Differences were found in the comparison of the genome sequences, which caused by deletions, insertions, and duplications during evolution. Based on these differential fragments, 715 pairs of NLRs gene specific primers were designed and used for PCR amplification among the wheat- Haynaldia villosa whole-arm translocation lines, Chinese spring, andHaynaldia villosa. Based on the results of chromosomal localization, a total of 174 specific Indel molecular markers were developed for each chromosome arm of Haynaldia villosa, and the polymorphism rate reached 24.3%. These special molecular markers developed based on NLRs can be used to assist the selection and identification of chromosomal engineering materials such as the translocation lines. At the same time, it established foundation for the subsequent mapping and cloning of the functional genes.

Key words: Haynaldia villosa;R gene;Molecular marker;Chromosomal localization

1 引言

小麦是我国重要的粮食作物，但随着农业的现代化发展以及对小麦品种的定向选择，造成了小麦基因资源、遗传资源、种质资源的严重流失，小麦品种多样性受到破坏。这不但降低了我国小麦的产量与品质，也增加了农民对小麦病虫害防治的成本，降低了经济效益和农民生产的积极性。对于小麦病害造成的严重损失，培育具有抗性功能的小麦新品种是最为经济有效的一种方法。但是小麦常规育种的育种周期长，材料抗性鉴定费时费力，这使得小麦育种效率较低。分子标记辅助育种的出现，可以通过基因型的选择来判断表型，在苗期即可进行相应性状的选择，不再受环境因素的制约，极大地提高了育种效率[12

植物先天免疫系统由两个主要的免疫反应组成，即病原相关分子模式激发的免疫反应（PTI）和效应蛋白激发的免疫反应（ETI）。其中，PTI由病原微生物表面的病原相关分子模式（PAMP）（如多糖、鞭毛蛋白等）刺激诱导，可导致植物产生非特异性的防卫反应（基础防卫反应）；ETI则是由植物抗病基因（Resistance gene，R基因）编码的抗病蛋白识别病原微生物产生的效应蛋白（即无毒蛋白，avr蛋白）引发，可使植物产生特异性的防卫反应（Jones and Dangl，2006）。对于R基因的研究一直是作物抗病性研究的热点。已有的研究表明植物的R蛋白在结构上非常保守，其中最大类属于编码包含核苷酸结合位点（nucleotide-binding site，NBS）和亮氨酸重复结构（leucine-rich repeat，LRR）保守基序的抗病蛋白（Dangl and Jones，2001；Hulbert et al.，2001），即NB-LRRs（以下简称NLRs）。已克隆的60多个R基因中80%以上都属于NLR类。

当今以PCR为核心的分子标记广泛应用于分子辅助育种。以PCR技术为核心的分子标记被称为第二代分子标记主要包括STS、RAPD、AFLP、SSR、Indel等。其中RFLP是根据基因型之间限制性片段长度的差异进行设计。STS以生物的基因组中常存在大量的单拷贝序列设计开发的标记。RAPD标记是利用合成的随机引物(一般为8～10个碱基)对基因组DNA进行PCR扩增。SSR标记是指基因组中存在的由2- 5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。而Indel分子标记根据同源序列间的插入或缺失序列进行设计分子标记自身具有开发成本低，结果准确，操作简单多态率高的特点[15]。

簇毛麦作为小麦抗病育种的重要基因库，携带抗白粉病、条锈病、秆锈病等数十种病害的抗性基因或位点，但其滞后基因组研究严重限制了其优异抗病基因的发掘和应用。从现有的报道来看对簇毛麦NLR类基因组的研究较少，而且大多集中在1V和6V染色体上[2`7]。簇毛麦分子标记开发大多以SSR 标记和STS标记较为常见，少有簇毛麦Indel分子标记相关的报道。本研究正是根据分子标记以及R基因在育种中的重要作用，以及簇毛麦的研究现状和Indel分子标记易开发的特点，对簇毛麦进行Indel了分子标记的开发，为后续的染色体工程材料的选育和鉴定和相关功能基因的定位和克隆奠定基础。

2 材料与方法

2．1 实验材料

实验材料包括普通小麦中国春( Triticum aestivum，CS)、二倍体簇毛麦品系91C43 (Haynaldia villosa，HV)、硬簇麦（ABV)、整套小麦—簇毛麦整臂易位系。其中所用到的簇毛麦来自于英国剑桥植物园，而普通小麦中国春( CS)、二倍体簇毛麦品系91C43 ( HV)、整套小麦—簇毛麦整臂易位系(ABV)均由南京农业大学细胞遗传所提供。

2．2 试验方法

2．2．1簇毛麦NLRs基因的测序 因簇毛麦和大麦的亲缘关系较近，根据NLRs类基因保守结构域设计合成大麦NLRs专化RNA-Baits文库（TSL）并作为为钓饵，通过分子杂交富集二倍体簇毛麦品系91C43的基因组水平的NLRs类基因，富集的簇毛麦NLRs基因序列经第三代高通量测序技术PacBio测序，获得簇毛麦全基因NLRs类基因的序列数据库。

2．2．2 簇毛麦Indel分子标记引物设计 簇毛麦通过Renseq-Pacbio测序并组装获得了含有NLRs基因的contig。根据已获得的簇毛麦NLRs基因的contig与普通小麦IWGSC数据库中的参考序列进行进行Blastn。依据其比对出的结果寻找二者同源序列间差异，尤其是插入或缺失区段。在比对的过程中，选择在两个插入或缺失多于3个碱基的序列位点处分别设计正向和反向引物，两个差异位点在200bp-500bp之间，利用软件 Primer 5 进行引物设计，引物长度 18-24bp，Tm 54-58℃，GC 含量 40-60%。此次实验所用到的引物由金斯瑞引物科技公司合成。

2．2．3整套小麦—簇毛麦整臂易位系鉴定 对整套小麦—簇毛麦整臂易位系的鉴定采取分子标记鉴定法。对于被鉴定的实验材料，先提取其DNA。然后根据已开发的簇毛麦的特异分子标记合成引物，再以提取实验材料的DNA为模板进行PCR扩增，根据凝胶电泳结果进行判断。如果可以扩增出特异片段则说明实验材料符合要求，可以进行下一步DNA的提取。如果不能扩增出特异片段则需要继续选择新的实验材料进行DNA的提取。

2．2．4实验材料DNA提取 此次实验对于植物材料DNA的提取采用的是常见的CTAB法，分为以下几个步骤；

1、首先制备缓冲液，再剪取鉴定后的植株叶片放入到含有液氮的研钵中。将植株叶片充分研磨到粉末状后，装入到2ml离心管中。

4、将上清液移到另一离心管中，加入二倍体积预冷的-20℃无水乙醇。混匀后，在-20℃冰箱中放置30min。

5、在DNA产生沉淀后，挑出DNA并用70%的乙醇洗涤2-3次，以提高DNA净度。最后将洗好的DNA挑出，于真空干燥器中抽干，加入适量无菌水溶解。

2．2．5簇毛麦NLRs基因分子标记的扩增 选取已经设计好的715对引物分别以中国春( CS)、二倍体簇毛麦品系91C43 ( HV)、硬簇麦（ABV)以及相对应的整套小麦—簇毛麦整臂易位系为模板，使用新合成的InDel标记引物进行 PCR 扩增。实验过程中的PCR反应体系（10μL）如下：模板DNA 1μL，左右引物各0.2μL， 2×Taq Buffer 5μL，ddH2O 3.6μL。震荡并离心后加入石蜡进行封口，以防止反应体系在PCR过程中因水分蒸发而导致引物不能扩增出特异片段。PCR反应程序如下；94℃ 3min、94℃ 30S、55-57℃ 45S、72℃ 45s、33个循环、72℃ 10min。在实验的过程中可根据实验的具体要求对PCR反应程序进行调整。例如扩增片段出现条带距离近或差异片段不明显的现象，则可以通过调整 PCR 程序中的退火温度、延伸时间以及循环.啊啊