文 献 综 述

1.琥珀酸概况

琥珀酸, 学名丁二酸, 广泛存在于人体、动物、植物和微生物中, 是三羧酸循环(TCA)的中间产物之一。琥珀酸是许多大宗化学产品如1,4 -丁二醇、四氢呋喃、C-丁内酯和己二酸等的中间原料, 可以取代很多基于苯和石化中间产物的商品。传统的琥珀酸生产是以不可再生战略资源石油为原料, 而目前石油储量在不断减少, 价格在不断增长, 并且石油工业对环境有很大的负面影响, 这促使了琥珀酸生物合成工业的研究和发展。微生物发酵生产琥珀酸以可再生资源糖和二氧化碳等作为主要原料, 不仅摆脱了对石油化工原料的依赖,而且可以固定二氧化碳, 减少温室气体,绿色环保, 具有一定的环境效益。

2.大肠杆菌发酵产丁二酸

近年来, 为了推进生物合成琥珀酸工业的高效发展,人们在大肠杆菌菌株筛选、代谢途径的改造、发酵工艺和分离纯化等方面进行了大量的研究。特别是在大肠杆菌代谢途径改造方面,通过强化琥珀酸合成途径、抑制琥珀酸旁路代谢途径等方法, 平衡细胞中氧化还原力,解除TCA 还原臂中还原力的限制,提高细胞生长率和琥珀酸生产率[1]。 厌氧条件下,大肠杆菌以糖或其衍生物为底物进行混合酸发酵,发酵产物为甲酸、乙酸、乙醇、乳酸和琥珀酸等,其中琥珀酸得率较低,一般低于0.2mol/mol葡萄糖[2]。大肠杆菌有两种葡萄糖消耗方式,一是葡萄糖经磷酸转移酶系统( PTS)转移和磷酸化，以磷酸烯醇式丙酮酸( PEP)为辅助底物, 1mol葡萄糖转化生成1mol PEP和1mol丙酮酸；二是葡萄糖借助半乳糖协同运输系统的半乳糖渗透酶到达细胞体内, 经葡萄糖激酶磷酸化进入糖酵解途径, 1mol葡萄糖最终转化为2mol PEP。PEP可以被PEP羧化酶和丙酮酸激酶利用, PEP羧化酶催化PEP固定二氧化碳,生成草酰乙酸进入C4途径, 继而被后续的苹果酸脱氢酶、富马酸酶和富马酸还原酶转化为琥珀酸(由草酰乙酸到琥珀酸的反应属于TCA循环还原性分支,称为TCA还原臂)。丙酮酸激酶不能固定二氧化碳, 但可将PEP转化为丙酮酸, 由此进入典型的混合酸发酵途径, 主要产生甲酸、乙酸、乙醇和乳酸等。大肠杆菌PEP在琥珀酸代谢中占有重要位置, 其代谢流分布受到细胞机制的高度调控, 是混合酸发酵代谢网络的重要节点。

PEP 羧化酶催化C3中间产物( PEP )回补C4途径, 是产琥珀酸代谢途径的关键酶和重要回补酶。PEP羧激酶是糖异生酶, 催化草酰乙酸脱羧和磷酸化反应生成PEP, 但在以葡萄糖为底物的培养基中也显示出这一重要活性。代谢通量分析表明,PEP 羧化酶和PEP 羧激酶催化所产生的反向代谢流,在动力学水平上受PEP 和草酰乙酸浓度的控制[3]。大肠杆菌有两种苹果酸梅, 分别依赖于NAD 和NADP , 催化丙酮酸(C3)固定二氧化碳 生成苹果酸(C4),回补C4 途径, 是重要的回补酶。其中依赖NAD 的苹果酸酶可催化丙酮酸和苹果酸之间的可逆反应, Km值分别为16和0.26mmol/L, 因此该反应更有利于丙酮酸的生成, 但在高浓度丙酮酸时, 反应趋向苹果酸的生成[4]。富马酸酶B和富马酸酶A分别在无氧条件下和有氧条件下催化苹果酸形成富马酸。富马酸还原酶以富马酸为最终电子受体催化富马酸转化为琥珀酸。

上述分析表明PEP 羧化酶、PEP羧激酶、苹果酸酶、苹果酸脱氢酶、富马酸酶和富马酸还原酶等都是大肠杆菌厌氧发酵生产琥珀酸的重要酶, 而PEP、草酰乙酸、苹果酸和丙酮酸等中间产物为代谢流分配的重要节点。应用基因工程技术提高大肠杆菌琥珀酸产量的策略主要有: 过量表达大肠杆菌内源或外源的二氧化碳固定酶, 如PEP羧化酶、PEP 羧激酶、苹果酸酶和丙酮酸羧化酶等, 引导碳流流向草酰乙酸或苹果酸结点, 强化琥珀酸合成途径; 敲除丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶和乙酸激酶等, 抑制琥珀酸合成途径的竞争途径, 降低乳酸、甲酸、乙醇和乙酸等副产物产量, 增加琥珀酸生成途径的代谢流分配; 激活乙醛酸循环, 改变NADH/NAD 比率, 解除NADH对TCA还原臂的限制; 构建大肠杆菌琥珀酸生产体系, 提高细胞生长率和碳流产出率, 从而提高琥珀酸生产强度。

3.生物电化学

生物电化学系统（Bioelectrochemical systems, BESs）是利用吸附在任一个或两个电极上的微生物催化氧化反应（生物阳极）或（和）还原反应（生物阴极）的生物电化学反应器[5]，近年来引起越来越多研究者们的兴趣。BESs还广泛应用于重金属还原[6-9]、硝酸盐去除[10]、卤代烃脱氯[11]及燃料和有机物的合成[8, 12-16]. 其中，BESs在合成能源物质方面的应用具有更重要的应用价值，尤其是利用BESs驱动微生物代谢，将温室气体二氧化碳去除同时产生附加值更高的燃料或化学制品（如乙酸、琥珀酸等生产），正受到科研工作者们的强烈关注。在生物电化学系统中微生物作为电催化剂，催化合成能源物质或化学制品的过程也被称作微生物电合成（Microbial electrosynthesis）。

利用微生物催化电合成进行二氧化碳固定的潜在优势[17]在于：（i）廉价易得的电子受体；（ii）减少日益增大的温室气体浓度；（iii）微生物电合成的能量效率是植物光合作用的100倍；（iv）与生物质作原料生产化学燃料相比，微生物电合成不需要大量的耕地、水。