1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述在我国实施”绿色中国”和”健康中国”的战略背景下，农业可再生资源有效利用与功能性食品开发制备的产业需求日益增长。豆渣是豆制品加工过程中的主要废弃物，豆渣中含有丰富的发酵可利用碳源，因此豆制品加工废弃物用于发酵原料并进一步高值生物转化的研究价值和应用潜力巨大。 1 豆渣的概述 1.1 豆渣及其现状豆渣是生产豆奶或豆腐过程中的副产品，每年全球豆渣的产量高达2.24亿吨[1]。大豆中有一部分营养成分残留在豆渣中，一般豆渣含水份85%，蛋白质3.0%，脂肪0.5%，碳水化合物（纤维素、多糖等）8.0%[2]，此外，还含有钙、磷、铁等矿物质。研究发现[2]，食用豆渣，能降低血液中胆固醇含量，减少糖尿病人对胰岛素的消耗。生产豆腐和豆奶过程的主要副产物即豆渣，传统的利用方式是将豆渣作为动物饲料，直接喂养牲畜，豆渣中很多高营养价值的成分利用率很低，因此如何充分利用产量日益增长的豆渣成为各国科研工作者亟待解决的问题之一。 1.2 豆渣的主要成分每100 g豆渣含能量1540 kj、蛋白质37.3 g、脂肪20.9 g、膳食纤维20.3 g、糖类7.7 g(包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等)、维生素e 38.34 mg，以及亮氨酸2570 mg、赖氨酸2030 mg、丝氨酸320 mg、苯丙氨酸1760 mg等15种氨基酸。在这些氨基酸中，人体必需的8种氨基酸它都含有。还含有钾1925 mg、钠1.8 mg、钙214 mg、镁302 mg、铁9.4 mg、锰2.31 mg、锌4.9 mg、铜0.74 mg、磷655 mg、硒3.10 mg等10种矿物质元素[3]。 1.3 现代技术应用豆渣的现状第一，发酵技术在豆渣中的应用较为广泛[4]：采用羊肚菌对豆渣进行半固体发酵可得发酵产物中的多糖含量8.86%、通过超声波辅助提取灵芝多糖得灵芝多糖产量为115.47 mg/g，并且具有较强的抗氧化作用和免疫调节活性；以豆渣为底物采用固态发酵法制备多糖，通过响应面法优化发酵条件，最终获得59.15 mg/g的多糖，另外通过超声辅助在发酵过的豆渣中进行多糖的提取又可获得多糖106.74 mg/g。利用解脂耶罗威亚酵母对豆渣进行固态发酵，发酵产物中脂质、琥珀酸和谷氨酸盐含量增加，抗氧化能力也显著增强，还使豆渣具有了大量的鲜味物质，使其更有营养，更适宜加入到食品中。第二，挤压技术在豆渣中的应用[5]：挤压技术是使物料通过机械作用辅以高温、剪切作用，使物料组织结构发生改变，使其更利于应用。对豆渣进行挤压膨化并对产物结构和膨化度进行研究，经响应曲面法优化得出最优挤压膨化条件，在此条件下产物膨化度较好且结构疏松。通过挤压技术，可改变豆渣中的水分及纤维含量，使其可以更好的应用于食品中。 2 枯草芽孢杆菌概述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)[6-7]，是芽孢杆菌属的一种，革兰氏阳性菌，好氧菌cas号68038-70-0。单个细胞0.7～0.8#215;2～3 um，着色均匀，无荚膜，周生鞭毛。其芽孢孢子0.6～0.9#215;1.0～1.5 um，呈现椭圆或者柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不涨大。菌落表面粗糙不透明，颜色污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。枯草芽孢杆菌可以利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚，枯草芽孢杆菌能够高效利用葡萄糖产生各类有益产物[8]，诸如：各种抑菌活性物质#8212;#8212;枯草菌素、制霉菌素；提高免疫力的各种维生素；作用于消化道的各种物质#8212;#8212;纳豆激酶、乳酸。在枯草芽孢杆菌中，葡萄糖的主要代谢途径由糖酵解（emp）、磷酸戊糖途径（hmp）和三羧酸循环（tca）三个部分组成[10]。其中磷酸戊糖途径（hmp）通量占葡萄糖分解代谢比率较低，加入一定的促进剂可以使葡萄糖的分解代谢流在emp、hmp和tca中合理分配，促进葡萄糖的分解代谢。枯草芽孢杆菌有木糖的运输和代谢系统，能够吸收和代谢木糖，但是枯草芽孢杆菌不能以木糖作为唯一碳源和能源生长，只有在先行利用l-阿拉伯糖和葡萄糖的情况下才能继续吸收和代谢木糖[9]。 3 纳豆激酶的研究进展 3.1 纳豆激酶的简介纳豆激酶(nattokinase简称nk)又名枯草杆菌蛋白酶[11-12]，是在纳豆发酵过程中由纳豆芽孢杆菌(bacillus natto)利用糖类及其他物质产生的一种丝氨酸蛋白酶（单链多肽酶），分子量为27728 d。纳豆激酶能够有效调节人体肠胃环境，因为纳豆激酶与粘性物质混合后，在ph值2-3的酸性环境中，还能保持不超过7.5%的活性，所以它不受胃液等人体内的酸性物质影响，能够更好地发挥功效[13]。在杀灭病菌的同时，纳豆激酶还能够有效控制肠道的菌群平衡，从而促进排便，减轻便秘，调理肠胃。同样的[15]，在遭遇腹泻、肠炎等问题的时候，也可以通过纳豆激酶来进行调节。纳豆激酶还可以溶解肠道毛细管中的脂肪、血栓等成分从而起到排毒调理的效果。纳豆激酶的体内溶栓活性为纤溶酶的四倍，在体内作用迅速、持续时间长，还能激活体内的tpa，使之温和、持续地提高血液的纤溶活。 3.2 纳豆激酶的国内外研究纳豆激酶是近年来研究的重点[16]，它是从纳豆中提取的一种枯草杆菌蛋白激酶，溶解肠道毛细管中的脂肪、血栓等成分从而起到调节肠胃的效果，有效控制肠道的菌群平衡。这种激酶主要是在纳豆的发酵过程中产生的，属于一种活性物质，该酶在人的肠道中能够较好地吸收，且研究和生产成本较低，越来越受到人们的关注。国外的研究[16]主要集中在纳豆激酶的活性和分离纯化等方面，尤其是日本已经达到分离纯化并分子克隆的水平，同时对纳豆激酶的生理功效和作用机理也研究的比较彻底。国内对于纳豆激酶的研究开展的相对较晚，上个世纪九十年代起才开始，主要集中在优良菌种选育、培养条件的优化、分离纯化方法的选择、体内外溶栓动物实验等方面，但都处于摸索阶段，至今还未见有将纳豆激酶开发成溶栓药物的报道。目前可以通过传统诱变育种和分子育种获得高产纳豆激酶的纳豆芽孢杆菌菌株。纳豆激酶的发酵生产工艺有两种，比较传统的是固体发酵[17-19]。目前商业化生产的纳豆激酶固态发酵工艺多基于日本纳豆的发酵工艺，发酵基质也是以黄豆为主。通过固态发酵的纳豆激酶产品可以作为发酵食品食用，也可通过进一步分离提取制备不同级别的纳豆激酶类产品（如纳豆胶囊和纳豆激酶胶囊）。目前，商业化应用的固态发酵工艺的纳豆激酶活性一般能达到20～100 fu/g。此外，还可以利用搅拌式发酵罐对纳豆芽孢杆菌进行液态发酵产纳豆激酶，液态发酵具有传质均匀，发酵过程检测技术成熟、可控，能够实现自动连续化和易于放大等优势[20-22]。 4 展望虽然现在用豆渣作为碳源去产纳豆激酶的研究很少，但是随着时代的发展和科技的进步，豆渣将逐渐被应用于各个领域中，这不仅提高了豆渣的利用率，还解决了废弃豆渣对环境所造成的问题，因此用豆渣的作为碳源去产纳豆激酶相关性研究是非常有必要的，相信在不久的将来，以豆渣的豆制品加工废弃物将会作为一种非常重要的加工原料，使纳豆激酶的产量加倍，让纳豆激酶更多地出现在人们的视线之内。

参考文献

[1] 李鑫宇，孙冰玉等. 豆渣的综合利用及研究进展[j]. 大豆科技, 2018, (4): 35-42.

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

研究内容：

本课题以枯草芽胞杆菌（bacillus subtilis)为出发菌，研究豆渣主要成份葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等分别做为碳源时对纳豆激酶合成的影响。考察分别以葡萄糖和木糖作为底物时的纳豆激酶比酶活，发酵过程菌浓度变化及生产强度，分析葡萄糖和木糖对于纳豆激酶的合成与分泌及发酵过程菌体生长和代谢速率的差异。同时考查以葡萄糖和木糖做碳源时稳定期培养液的氧化还原电位，分析微环境的氧化还原性对纳豆激酶合成的影响。在此基础上，考察以不同h:p比例的混合糖为底物进行发酵时，枯草芽孢杆菌菌体浓度及生产强度、纳豆激酶比酶活等的差异，分析枯草芽胞杆菌对不同h:p比例混合糖的利用特性与纳豆激酶得率，并最终实现以豆制品加工废弃物为底物直接进行发酵，建立纳豆激酶高比酶活与高生产强度的发酵工艺。