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摘 要

血管生成是许多生理和病理过程中的关键一环。血管抑制活性化合物可作为治疗异常血管生成疾病的治疗药物。对香豆酸甲酯（pCAME）是闭鞘姜（Koen）Sm的成分（姜科）。 闭鞘姜是生长在菲律宾，印度，斯里兰卡和马来西亚的一种草本植物。种植物的根茎可以用于治疗蠕虫，消化不良，卡他性发热和一些皮肤病。已有研究，pCAME具有抗黑变性，抗氧化性和抗微生物活性，引起了我们对其血管活性的研究的兴趣。

斑马鱼因为其基因与哺乳类动物具有高度保守性这一特点使之成为研究化学物质临床安全性的理想生物模型。本实验选择了转基因斑马鱼（fli-1：EGFP）模型，发现pCAME抑制了斑马鱼发育中体节间与肠下网血管的生成。为进一步研究，我们选用了vegfa，ang-1，ang-2及其受体flt-1，flk-1，tie-1，tie-2血管发育相关基因作为代表来研究pCAME诱导抗血管生成的分子机制。发现pCAME抑制了vegf / vegfr和ang / tie信号通路的表达。PCAME有成为血管生成抑制剂的潜能，可作为先导化合物开发成抗血管生成药物。

关键词： 体节间血管 肠下静脉血管 对香豆酸甲酯 斑马鱼 抗血管新生

ABSTRACT

Angiogenesis is a key link in many physiological and pathological processes. Angiostatic compounds can be used as therapeutic agents for treating abnormal angiogenic diseases.Methyl coumarate (pCAME) is a component of Koen Sm (Gingeraceae). Ginger is a herb that grows in the Philippines, India, Sri Lanka and Malaysia. The rhizomes of the plants can be used to treat worms, indigestion, catarrhal fever and some skin diseases. It has been studied that pCAME has anti-blackening, anti-oxidation and anti-microbial activity, which has aroused our interest in the study of its vasoactive activity.

Zebrafish is an ideal biological model for studying the clinical safety of chemical substances due to its highly conserved nature of mammals and mammals. In this experiment, the transgenic zebrafish (fli-1:EGFP) model was selected and it was found that pCAME inhibited the formation of intravascular and subinvasive vasculature in zebrafish development. For further study, we used vegfa, ang-1, ang-2 and its receptors flt-1, flk-1, tie-1, tie-2 angiogenesis-related genes as representatives to study pCAME-induced anti-angiogenic molecules. mechanism. It was found that pCAME inhibits the expression of vegf / vegfr and ang / tie signaling pathways. PCAME has the potential to become an angiogenesis inhibitor and can be developed as an anti-angiogenic agent as a lead compound.

Keywords:ISV SIV pCAME Danio rerio Antiangiogenesis

目 录

摘 要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1斑马鱼模型的介绍与应用 1

1.1.1 斑马鱼简介 1

1.1.2斑马鱼模型在发现天然产物生物活性分子的意义 2

1.1.3斑马鱼在筛选抗血管抑制剂方面的的应用 3

1.2 新生血管抑制剂的研究 4

1.2.1 新生血管抑制剂的研究进展 4

1.2.2 筛选血管抑制剂的模型 4

1.3 对香豆酸甲酯的简介 6

第二章 实验材料与方法 7

2.1 引言 7

2.2 实验材料 7

2.2.1药物简介 7

2.2.2 主要试剂和仪器 8

2.2.3 对香豆酸甲酯体内抗血管新生活性检测方法 9

第三章 实验结果与讨论 14

3.1 对香豆酸甲酯对转基因斑马鱼体节间血管（ISV）和肠下静脉血管（SIV）的抑制作用 14

3.2定量评价对香豆酸甲酯对斑马鱼体节间血管（ISV）和肠下静脉血管（SIV）生成模型的抑制效果 15

3.3 qRT-PCR实验结果 17

3.4 实验总结 18

参考文献 19

致谢 22

第一章 文献综述

1.1斑马鱼模型的介绍与应用

斑马鱼简介

1.1.1.1 斑马鱼特性

斑马鱼大多分布于南亚国家。成熟的斑马鱼大约4-6cm长。斑马鱼的皮肤颜色为黄褐色，雌性与雄性的颜色稍微有点不同，雌性偏银灰而雄性则偏黄色。其皮肤表面从头部到尾部均覆盖有蓝靛色条纹，所以又叫蓝条鱼。斑马鱼鳍条宽大伸展，身形流畅，外观美丽^[1]。

自二十世纪九十年代,斑马鱼就开始被用于研究新药的筛选。斑马鱼养殖方便、体外受精且产卵量大，是低费用的实验器材。此外，斑马鱼受精后72hpf全身透明,因此可直观监测多个器官对药物的毒性及致畸性反应。斑马鱼模型实验过程观察方便、药物用量少、实验周期短，实验结果可全自动化分析，该模型由于这些优点逐渐发展成为成为遗传学、分子发育生物学、环境毒理学等学科的热点模型。斑马鱼还因为其基因与人类基因有高达87%的同源性^[2]而受到生物学家的重视，因其在很大程度上表明对其所做实验得出的数据对人体同样适用。

1.1.1.2 斑马鱼的生活习性及日常护理

养殖时，环境温度应该保持在在24-30 ℃这个范围内^[3]。冬天必须给其充足的取暖以防止它因为受凉而死亡。相比于温度，斑马鱼对水质的要求不算很高，弱碱性水即可，但至少需要曝气1天。每天都要将鱼缸中的残饵和粪便清除，并进行换水，每次 1/3左右就可以，处于孵化期的斑马鱼耗氧极少。到长到成鱼状态，斑马鱼生长代谢速度明显快于其它大型鱼类，所以氧气需求量也要高许多^[4]。实验室养殖斑马鱼，应充足供氧。

斑马鱼每天需要投喂 2—3次，如果正处于繁殖状态，在这个基础上加上一次即可，每次的喂食量应该控制在在5 min之内吃完。投喂时，使用鲜活饵料、人工合成饵料都可以，多种饵料结合起来投喂效果更佳。对于正在繁殖的亲鱼，饵料中需添加一些V A 、V D 、V E 等促进性腺发育的元素^[3]，Fe、Zn等微量元素也要适当添加。

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