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摘 要

纤维素作为自然界最丰富的有机物，是一种可再生资源，但其利用却是一大难题。酶法降解纤维素等生物质虽具有反应条件温和、无副产物和污染少等优点，但仍有很大困难，如水解速度慢，酶用量大，且需要多种酶的协同作用。面对人类社会日益严峻的能源危机，开发新型高效的纤维素酶以利用纤维素这一可再生资源就具有重要意义。本课题主要研究一个持续性内切葡聚糖酶EG5C-1的酶学性质。

关键词：纤维素 纤维素酶 持续性内切葡聚糖酶 酶学性质

enzymatic properties of the new-type processive endoglucanase EG5C-1

ABSTRACT

Cellulose，the most abundant organics in the nature，is a sort of renewable resource，but it is hard to use cellulose. There are many advantages to degrade cellulose using enzyme such as moderate reaction condition, no by-product and little pollution，yet difficulties exist, like slow hydrolysis rate，large consumption of enzyme and necessary synergistic effect. Facing the increasingly serious energy dilemma，it is of great significance for us to exploit late-model and high-efficiency cellulase to make use of the renewable resource. The main content of this project is the enzymatic properties on a new-type processive endoglucanase EG5C-1.

Key words: cellulose; cellulose; processive endoglucanase; enzymatic properties

目录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅰ

第一章 文献综述 1

1.1. 纤维素 1

1.1.1 纤维素的来源 1

1.1.2 纤维素的化学组成及结构 1

1.1.3 纤维素的用途 1

1.2. 纤维素酶 1

1.2.1 内切葡聚糖酶 2

1.2.2 外切葡聚糖酶 2

1.2.3 β-葡萄糖苷酶 2

1.3. 纤维素酶的应用 2

1.3.1 纤维素酶在纺织上的应用 3

1.3.2 纤维素酶在食品工业中的应用 3

1.3.3 纤维素酶在酿造行业的应用 3

1.3.4 纤维素酶在造纸行业的应用 4

1.4. 纤维素酶相关理论研究 4

1.4.1 纤维素酶的活力测定方法 4

1.4.2 纤维素酶的纯化方法 4

1.4.3 纤维素酶的协同作用机制 4

1.5. 纤维素降解酶系的研究进展 5

1.6. 持续性内切葡聚糖酶的研究现状 5

1.7. 本课题研究意义 6

第二章 实验材料与方法 7

2.1. 实验试剂，器材及其他材料 7

2.1.1 实验器材 7

2.1.2 实验试剂 8

2.1.3 其他材料 8

2.2. 实验方法 9

2.2.1 持续性内切葡糖苷酶EG5C-1突变体的筛选 9

2.2.2 EG5C-1突变体的构建 9

2.2.3 EG5C-1突变体的表达与纯化 12

2.2.4 EG5C-1及其突变体的活力测定 12

2.2.5 EG5C-1及其突变体的酶学性质 14

第三章 结果与讨论 15

3.1. EG5C-1突变体的虚拟筛选 15

3.2. EG5C-1及其突变体的表达与纯化 16

3.3. 酶活力测定 17

3.4. 酶学性质 18

3.5. 结果与讨论 20

3.6. 展望 20

参考文献 21

致谢 24

1. 文献综述

1.1. 纤维素

1.1.1 纤维素的来源

在自然界中，纤维素作为一种由葡萄糖单体构成的同多糖，含量最多且分布最广。与此同时，其还是植物结构细胞壁的重要组成成分。它是地球上最古老的天然高分子，是永不枯竭的可再生资源，它组成叶干重的约10%，木材的gt;50%，麻纤维的70%-80%，棉纤维的90%-98%，但纤维素不仅仅存在于植物界，比如海洋无脊椎动物被囊类在其外套膜中含有相当多的纤维素^[1]。

1.1.2 纤维素的化学组成及结构

纤维素大分子的基环是脱水葡萄糖，其分子式为(C₆H₁₀O₅)_n，若干β-D-葡萄糖残基彼此以β-1,4糖苷键连接，形成线形葡聚糖^[2]。纤维素链中每个残基相对于前一个残基翻转180°，因此纤维二糖可看成是纤维素的二糖单位^[1]。纤维素内部交错形成无定形区域和结晶区域^[3]。

1.1.3 纤维素的用途

纸和纺织品主要来自天然纤维素。改型纤维素有其他用途，比如乙基纤维素是一种热塑塑料和粘合剂，醋酸纤维素是最重要的纤维素酯，可用于制造各种薄膜，生化实验中常用醋酸纤维素薄膜，羧甲基纤维素和微晶纤维素在食品工业中分别用作粘稠剂和填充剂^[1]。

1.2. 纤维素酶

纤维素酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，三种纤维素酶协同作用才能降解纤维素^[4]。某些反刍动物肠道内共生着能产纤维素酶的细菌，因此能消化纤维素。白蚁消化木头则依赖于消化道中的原生动物。人和其他哺乳动物不含纤维素酶，所以不能消化芹菜等纤维食物。

1.2.1 内切葡聚糖酶

内切葡聚糖酶作用于纤维素多糖链上的无定形区域，通过随机地水解 β-1,4-糖苷键将长链的纤维素大分子截短,产生带还原性末端的小分子纤维素^[5]。其表观分子质量在22-45kDa之间，最适温度在50-70℃之间，最适pH偏酸性。自然界中的多种生物可以产生内切葡聚糖酶，但主要来源于土壤中的各类细菌和真菌，各种微生物产生的内切葡聚糖酶对自然界的碳循环起着非常重要的作用^[5]。可以理解，内切葡聚糖酶的空间构象如同凹槽（groove），活性中心位于结构开放的凹槽之中。显然，凹槽有利于纤维素链内部的某一位点直接进入然后将其切断。

1.2.2 外切葡聚糖酶

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